探讨JAK2抑制剂Ruxolitinib对JAK2V617F突变阳性的骨髓增殖性肿瘤（MPN）细胞内基质金属蛋白酶（MMP）调控的影响。
①收集2012年1月到2015年12月保定市第一医院收治的40例未经治疗的JAK2V617F阳性MPN患者，以15名健康志愿者为对照组。免疫组化法检测两组骨髓活检组织中磷酸化JAK2（p-JAK2）、基质金属蛋白酶2（MMP-2）、MMP-9的表达水平。选取JAK2V617F阳性MPN患者骨髓细胞，体外应用Ruxolitinib干预，测定干预前后细胞迁移力和MMP-2、MMP-9表达。②不同浓度Ruxolitinib（0、50、100、250、500、1 000 nmol/L）作用于人红白血病细胞株HEL细胞不同时间后CCK-8检测细胞活力，Tanswell小室检测细胞迁移，荧光定量PCR检测JAK2、MMP-2、MMP-9 mRNA水平变化，Western blot检测p-JAK2、MMP-2、MMP-9蛋白表达。
①MPN组p-JAK2、MMP-2、MMP-9蛋白表达均高于对照组[（78.56±24.55）%对（41.59±17.29）%、（48.25±18.74）%对（22.79±13.89）%、（53.29±19.28）%对（15.56±14.96）%，P值均<0.05]。Spearman相关分析显示MMP-2、MMP-9蛋白水平与JAK2V617F突变量呈正相关（r=0.526, P=0.001；r=0.543, P=0.001）。②Ruxolitinib能够呈时间和剂量依赖性抑制HEL细胞增殖。③迁移实验结果显示5 nmol/L Ruxolitinib作用MPN原代细胞及HEL细胞24 h后迁移至下室细胞数均少于无Ruxolitinib组（154.7±27.5对320.3±67.3，t=13.47，P=0.001；70.7±10.5对135.3±16.7，t=13.89，P=0.001）。④JAK2、MMP-2、MMP-9 mRNA及蛋白表达随Ruxolitinib剂量增加而降低。
Ruxolitinib通过调控JAK2信号通路抑制MMP-2、MMP-9表达而抑制MPN细胞迁移能力。
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骨髓增殖性肿瘤（MPN）是一类起源于造血干细胞、以骨髓一系或多系血细胞异常增殖为特点的血液系统恶性疾病。90%~95%的真性红细胞增多症（PV）及50%的原发性血小板增多症（ET）、原发性骨髓纤维化（PMF）患者存在JAK激酶2（JAK2）V617F点突变[1,2]。JAK2V617F突变导致JAK2持续激活，活化细胞因子受体-JAK2-STAT5信号通路，引起细胞增殖和凋亡受抑，导致疾病的发生。Ruxolitinib是选择性JAK1/2抑制剂[3]，通过竞争性抑制JAK1/2激酶结构域、催化亚基上ATP结合位点起到对JAK活性的抑制作用，从而导致STAT-3/5、Akt和ERK磷酸化水平的下降[4]。基质金属蛋白酶（MMP）参与肿瘤细胞的侵袭和迁移过程，介导包括基底膜在内的细胞外基质（extracellular matrixc, ECM）的降解，还参与调控肿瘤血管生成，影响细胞黏附分子的功能以及调控肿瘤细胞的生长。目前研究表明，MMP-2及MMP-9在MPN中存在不同程度的表达[5]，而Ruxolitinib对MPN细胞MMP表达调控的影响未见报道。本研究观察JAK2抑制剂Ruxolitinib对MPN细胞增殖、凋亡及迁移能力的影响并探讨其作用机制，为MPN的临床治疗提供新的药物和治疗靶点。
2012年1月至2015年12月保定市第一医院收治的40例JAK2V617F突变阳性且排除MPLW515K/L及CALR突变的初诊MPN患者纳入研究（MPN组），男18例、女22例，中位年龄59（34~72）岁，PV 13例，ET 10例，PMF 17例，诊断均符合文献[6]。以15名健康志愿者作为对照组，其中男8名、女7名，中位年龄55（38~73）岁。本研究获得保定市第一医院伦理委员会批准。患者均知情同意。
采集MPN患者及健康志愿者骨髓标本2~5 ml；在无菌的塑料离心管中加入淋巴细胞分离液，提取骨髓单个核细胞，部分用于细胞培养，部分冻存备用。
人红白血病细胞株HEL细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。原代骨髓单个核细胞和HEL细胞在含10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培养液、37 ℃、5%CO2条件下培养。
CCK-8试剂盒购自日本同仁化学研究所。p-JAK2、MMP-2、MMP-9单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司。基因组RNA提取试剂盒购自北京博迈德生化科技有限公司，引物序列根据美国国立生物技术信息中心（NCBI）公布的相应基因序列设计，由北京赛百胜生物公司合成。Ruxolitinib购自瑞士诺华公司。ABI 7500荧光定量PCR仪购自美国Applied Biosystems公司。
分组收集细胞，RNA提取试剂盒提取总RNA，逆转录合成cDNA。实时荧光定量PCR引物序列及探针：JAK2上游引物：5'-CAGCAAGTATGATGAGCAAGCTTT-3'，下游引物：5'-TGAACCAGAATATTCTCGTCTCCAC-3'；MGB荧光探针5'-FAM-TCACAAGCATTTGGTTTT-MGB-3'；JAK2V617F下游引物：5'-CCAGAATATTCTCGTCTCCACTGAA-3'。MMP-2上游引物：5'-TGCGACCACAGCCAACTACAG-3'，下游引物：5'-GGTGCCAAGGTCAATGTCCAGG-AG-3'（241 bp）；MMP-9上游引物：5'-GGCACCCACACCACAACATCACCTAT-3'，下游引物：5'-AGGGACCACAACTCGTCATCGT-3'（289 bp）；β-actin上游引物：5'-GCGGACATCCGCAAAGAC-3'，下游引物：5'-AAAGGGTGTAACGCAACTAA-3'（302 bp）。反应体系25 μl，反应条件：50 ℃ 2 min，95 ℃10 min，1个循环；95 ℃15 s，60 ℃ 1 min，40个循环，同时设空白对照组。根据标准品计算JAK2和JAK2V617F的绝对拷贝数量。将JAK2V617F/JAK2比值定义为JAK2V617F突变量。根据公式（△Ct=Ct目的基因－Ctβ-actin和△△Ct=2－△Ct）计算相应基因的相对表达量。各组实验重复3次，结果取均值。
组织蜡块切片、烤片、脱蜡、抗原修复后加3%过氧化氢（阻断内源性过氧化氢酶的活性），磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗，加入一抗（p-JAK2、MMP-2、MMP-9，工作浓度为1∶100）4 ℃过夜，PBS洗3次，每次5 min，滴加Elivision plus试剂盒中试剂A（增强剂）、试剂B（酶标羊抗鼠/兔IgG聚合物），PBS冲洗后，加二氨基联苯氨（DAB）显色，苏木素复染，0.1%盐酸分化，自来水冲洗，切片经梯度酒精脱水干燥，中性树胶封片。以胞膜、胞质或胞核中出现棕黄色颗粒为阳性判断标准，在高倍镜视野下计数阳性细胞比例。
收集对数生长期细胞用于实验。①实验组：取细胞悬液100 μl接种于96孔板（细胞密度为5×103 ml），边缘孔用无菌水或PBS填充，加入不同浓度Ruxolitinib（50、100、250、500、1 000 nmol/L）。②空白组：加入100 μl培养基及不同浓度Ruxolitinib（50、100、250、500、1 000 nmol/L），不加细胞。③对照组：加入100 μl细胞，不加Ruxolitinib。每组设5个平行孔。分别于0、24、48、72 h后加入CCK-8溶液10 μl，4 h后酶标仪测定450 nm处吸光度（A）值，按以下公式计算细胞活力并绘制细胞生长曲线。
选取无FBS细胞100 µl（细胞数5×104），加入Transwell小室上室，加或不加5 nmol/L Ruxolitinib，下室加入含10%FBS RPMI1640培养基，24 h后显微镜下计数迁移至下室的细胞。
收集各组细胞（每组1×107），加入200 μl预冷蛋白裂解液和2 μl苯甲基磺酰氟（PMSF），4 ℃裂解1 h，考马斯亮蓝试剂盒检测上清液蛋白浓度。配制10%的分离胶和12%的浓缩胶，取蛋白样品加入上样缓冲液混匀，充分蛋白变性，电泳。转移到硝酸纤维素膜，经50 g/L脱脂奶粉37 ℃孵育2 h，加一抗，4 ℃孵育过夜。TTBS缓冲液漂洗，加入二抗，37 ℃孵育2 h，再次漂洗后行化学染色检测。
所有数据采用SPSS 19.0软件分析，计量资料以
±s表示，两组均数间的比较采用t检验，多组均数比较采用方差分析，两两比较采用q检验。Spearman等级相关分析各变量之间的相关性。以P<0.05为差异有统计学意义。
MPN组p-JAK2、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平均高于对照组（P<0.05）。详见表1、图1。
初诊骨髓增殖性肿瘤（MPN）患者及对照组p-JAK2、MMP-2、MMP-9蛋白表达（%，
±s）
初诊骨髓增殖性肿瘤（MPN）患者及对照组p-JAK2、MMP-2、MMP-9蛋白表达（%，±s）
| 组别 | 例数 | p-JAK2 | MMP-2 | MMP-9 |
|---|---|---|---|---|
| MPN组 | 40 | 78.56±24.55 | 48.25±20.74 | 53.29±19.28 |
| 对照组 | 15 | 41.59±17.29 | 22.79±13.89 | 15.56±14.96 |
| t值 | 5.342 | 4.387 | 7.668 | |
| P值 | <0.001 | <0.001 | <0.001 |
注：p-JAK2：磷酸化JAK激酶2；MMP-2：基质金属蛋白酶2；MMP-9：基质金属蛋白酶9
Spearman等级相关分析显示MPN患者的JAK2V617F突变量和MMP-2、MMP-9蛋白表达呈正相关（r=0.526，P=0.001；r=0.543，P=0.001）。40例JAK2V617F突变阳性MPN患者中，JAK2V617F突变量<50%、≥50%分别为22、18例。JAK2V617F突变量<50%组p-JAK2、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平均低于≥50%组（P<0.05），详见表2。
JAK2V617F突变对JAK2V617F突变阳性MPN患者骨髓组织p-JAK2、MMP-2、MMP-9蛋白表达的影响（%，
±s）
JAK2V617F突变对JAK2V617F突变阳性MPN患者骨髓组织p-JAK2、MMP-2、MMP-9蛋白表达的影响（%，±s）
| 组别 | 例数 | p-JAK2 | MMP-2 | MMP-9 |
|---|---|---|---|---|
| JAK2V617F突变量<50% | 22 | 72.84±17.57 | 41.20±17.21 | 47.38±17.36 |
| JAK2V617F突变量≥50% | 18 | 85.56± 20.56 | 56.87±23.32 | 60.51±19.65 |
| t值 | 2.111 | 2.444 | 2.243 | |
| P值 | 0.041 | 0.019 | 0.031 |
注：MPN：骨髓增殖性肿瘤；p-JAK2：磷酸化JAK激酶2；MMP-2：基质金属蛋白酶2；MMP-9、基质金属蛋白酶9
24、48、72 h作用时间组HEL细胞活力随Ruxolitinib浓度增大而逐渐下降（P<0.001），不同浓度Ruxolitinib处理组HEL细胞活力随作用时间延长而逐渐下降（P<0.001），表明Ruxolitinib能够呈时间和剂量依赖性抑制HEL细胞增殖。详见表3。
不同浓度Ruxolitinib对HEL细胞活力的影响（%，
±s）
不同浓度Ruxolitinib对HEL细胞活力的影响（%，±s）
| Ruxolitinib 浓度 | 样本数 | 细胞活力 | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 24 h | 48 h | 72 h | F值 | P值 | ||
| 50 nmol /L | 3 | 76.10±3.09 | 70.14±3.39 | 55.83±3.43 | 29.77 | <0.001 |
| 100 nmol /L | 3 | 66.04±3.14 | 59.71±3.34 | 47.63±3.12 | 25.61 | <0.001 |
| 250 nmol /L | 3 | 60.06±2.71 | 52.80±2.61 | 36.43±2.98 | 57.24 | <0.001 |
| 500 nmol /L | 3 | 59.27±2.86 | 43.30±2.96 | 31.05±2.78 | 73.05 | <0.001 |
| 1 000 nmol /L | 3 | 57.86±2.32 | 38.56±2.15 | 14.48±2.86 | 233.78 | <0.001 |
| F值 | 21.03 | 56.14 | 81.86 | |||
| P值 | <0.001 | <0.001 | <0.001 | |||
5 nmol/L Ruxolitinib作用MPN原代细胞24 h后迁移至下室细胞数少于无Ruxolitinib的空白组（154.7±27.5对320.3±44.3，t=13.47，P=0.001）。5 nmol/L Ruxolitinib处理HEL细胞24 h后迁移至下室细胞数少于无Ruxolitinib对照组（70.7±10.5对135.3±16.7，t= 13.89，P=0.001）。
Ruxolitinib处理HEL细胞48 h后，JAK2、MMP-2、MMP-9 mRNA表达水平均随Ruxolitinib浓度的增加而逐渐减低（P<0.001）。详见表4。
不同浓度Ruxolitinib处理HEL细胞48 h后JAK2、MMP-2、MMP-9基因mRNA相对表达量（
±s，n=3）
不同浓度Ruxolitinib处理HEL细胞48 h后JAK2、MMP-2、MMP-9基因mRNA相对表达量（±s，n=3）
| Ruxolitinib 浓度 | JAK2 | MMP-2 | MMP-9 |
|---|---|---|---|
| 0 nmol /L | 0.431±0.043 | 0.397±0.031 | 0.321±0.032 |
| 50 nmol /L | 0.362±0.032 | 0.362±0.030 | 0.252±0.025 |
| 100 nmol /L | 0.254±0.031 | 0.235±0.023 | 0.245±0.024 |
| 250 nmol /L | 0.181±0.022 | 0.188±0.018 | 0.215±0.025 |
| 500 nmol /L | 0.143±0.022 | 0.155±0.010 | 0.155±0.018 |
| 1 000 nmol /L | 0.099±0.011 | 0.098±0.009 | 0.098±0.009 |
| F值 | 61.77 | 86.82 | 33.90 |
| P值 | <0.001 | <0.001 | <0.001 |
注：JAK2：JAK激酶2；MMP-2：基质金属蛋白酶2；MMP-9：基质金属蛋白酶9
250 nmol/L Ruxolitinib作用48 h能明显抑制MPN原代细胞p-JAK2、MMP-2、MMP-9表达。详见表5。
Western blot检测250 nmol/L Ruxolitinib对骨髓增殖性肿瘤原代细胞p-JAK2、MMP-2、MMP-9表达的影响（
±s）
Western blot检测250 nmol/L Ruxolitinib对骨髓增殖性肿瘤原代细胞p-JAK2、MMP-2、MMP-9表达的影响（±s）
| 组别 | 样本数 | p-JAK2 | MMP-2 | MMP-9 |
|---|---|---|---|---|
| 未应用 Ruxolitinib | 3 | 1.55±0.34 | 1.42±0.31 | 1.33±0.29 |
| 应用 Ruxolitinib | 3 | 0.83±0.16 | 0.72±0.13 | 0.68±0.13 |
| t值 | 4.284 | 4.656 | 4.573 | |
| P值 | 0.003 | 0.002 | 0.002 |
注：p-JAK2：磷酸化JAK激酶2；MMP-2：基质金属蛋白酶2；MMP-9、基质金属蛋白酶9
不同浓度Ruxolitinib处理HEL细胞48 h，随着Ruxolitinib浓度的增加p-JAK2、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平逐渐减低（P<0.001）。详见表6、图2。
1~6分别为0、50、100、250、500、1 000 nmol/L Ruxolitinib组。p-JAK2：磷酸化Janus激酶2；MMP-2：基质金属蛋白酶2；MMP-9、基质金属蛋白酶9
Western blot检测不同浓度Ruxolitinib对HEL细胞p-JAK2、MMP-2、MMP-9表达的影响（
±s，n=3）
Western blot检测不同浓度Ruxolitinib对HEL细胞p-JAK2、MMP-2、MMP-9表达的影响（±s，n=3）
| Ruxolitinib 浓度 | p-JAK2 | MMP-2 | MMP-9 |
|---|---|---|---|
| 0 nmol /L | 1.52±0.12 | 0.53±0.04 | 0.78±0.06 |
| 50 nmol /L | 1.21.±0.10 | 0.42±0.03 | 0.65±0.04 |
| 100 nmol /L | 1.12±0.09 | 0.31±0.03 | 0.54±0.04 |
| 250 nmol /L | 0.98±0.07 | 0.27±0.02 | 0.30±0.02 |
| 500 nmol /L | 0.45±0.04 | 0.23±0.01 | 0.27±0.02 |
| 1 000 nmol /L | 0.15±0.01 | 0.19±0.01 | 0.23±0.01 |
| F值 | 119.71 | 73.40 | 121.32 |
| P值 | <0.001 | <0.001 | <0.001 |
注：p-JAK2：磷酸化JAK激酶2；MMP-2：基质金属蛋白酶2；MMP-9：基质金属蛋白酶9
费城染色体阴性MPN患者中存在JAK2V617F、JAK2基因第12号外显子、MPL基因第10号外显子及CALR基因突变，JAK2V617F突变发生率最高。JAK2V617F突变导致酪氨酸激酶过度活化从而持续激活JAK/STAT信号通路，引起细胞过度增殖[7]。JAK-STAT通路参与细胞增殖、分化和凋亡以及免疫调节等多种反应，在细胞因子受体介导的信号通路中起核心作用[8]。
Ruxolitinib是一种高选择性的JAK1/JAK2激酶抑制剂[9]，通过抑制JAK/STAT信号通路的磷酸化而发挥作用，能够明显逆转MPN患者脾脏肿大，并改善患者生存质量，没有脾脏肿大的患者也可明显获益[10]。既往研究表明，不同浓度Ruxolitinib可使JAK2V617F阳性Ba-F3细胞增殖明显受抑[11]。Ruxolitinib作用JAK2V617F阳性HEL细胞后，线粒体膜电位呈剂量依赖性减低，caspase3/7蛋白活性逐渐减低，从而诱导凋亡[12]。本研究结果显示Ruxolitinib作用于JAK2V617F阳性HEL细胞后，随着浓度的增加和时间的延长，细胞活力明显受到抑制。
肿瘤细胞的侵袭与迁移是一种复杂的过程，涉及肿瘤细胞运动、黏附、细胞外基质的降解等。研究显示Ruxolitinib通过抑制JAK2突变，抑制骨髓增殖性肿瘤VEGF等血管新生因子表达，进而抑制其血管新生[13]。MMP通过降解骨髓基质促进血管生成,改变与HSC动员和黏附有关的细胞因子、黏附分子的表达和功能,调控HSC的增殖分化，参与恶性血液病的发生和发展。白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征等多种血液病存在MMP异常表达[14,15]，在MPN中亦存在MMP表达上调[5]。本研究结果表明，JAK2V617F阳性MPN细胞中存在p-JAK2、MMP-2、MMP-9的高表达，同时MPN患者的JAK2V617F突变量与MMP-2、MMP-9表达呈正相关。Ruxolitinib作用于JAK2V617F阳性MPN细胞48 h后，JAK2 mRNA和p-JAK2蛋白水平呈剂量依赖性降低，MMP-2、MMP-9表达亦降低。Transwell小室迁移实验结果表明Ruxolitinib作用细胞24 h后，进入下室的细胞明显减少。本研究表明下调肿瘤细胞的MMP-2、MMP-9表达水平可抑制肿瘤细胞的转移，可能Ruxolitinib通过抑制JAK-STAT信号通路活化，干扰下游靶基因与MMP-2、MMP-9启动基因结合，下调MMP-2、MMP-9表达，从而抑制肿瘤细胞的侵袭及迁移。
本研究结果表明，在JAK2V617F阳性细胞中存在MMP-2与MMP-9高表达，同时与JAK2V617F突变量密切相关，Ruxolitinib能够抑制JAK2V617F阳性MPN患者原代细胞及HEL细胞迁移，并通过抑制JAK2介导的信号通路抑制肿瘤细胞MMP-2、MMP-9表达，进而抑制MPN细胞迁移，为靶向治疗JAK2V617F阳性MPN提供了理论依据。
