评估靶向二代基因测序（NGS）在先天性贫血诊断中的价值。
设计含217个先天性贫血相关致病基因的NGS基因组合——BDHAP-2014，对2014年8月至2017年7月连续就诊的临床怀疑诊断先天性贫血的患者进行NGS检测和亲代验证。
共纳入46例患者，临床疑诊分别为范可尼贫血（FA）11例、先天性红细胞生成异常性贫血（CDA）8例、先天性铁粒幼红细胞性贫血（CSA）6例、先天性溶血性贫血（CHA）12例、先天性角化不良（DC）1例、铁剂难治性缺铁性贫血（IR-IDA）4例及未明原因的血细胞减少（Uc）4例。经靶向NGS检测，28例（60.9%）患者明确了诊断和（或）分型，累及12个基因共44种致病性突变。其中26例（56.5%）基因诊断结果与临床疑诊相符，包括FA（5/11，45.5%）、CSA（6/6，100.0%）、CDA（3/8, 37.5%）及CHA（12/12，100.0%）；2例（4.3%）患者的基因诊断结果与临床疑诊不一致，依据NGS纠正了诊断，包括1例DC和1例家族性噬血细胞性淋巴组织细胞增生症（FHL）；12例CHA依据基因检查结果进一步明确了溶血类型。18例（39.1%）患者未明确致病基因，最终未能明确诊断。
NGS对临床疑诊先天性贫血患者具有重要的诊断价值，可为临床治疗选择提供依据。
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正确的诊断是合理治疗的前提。范可尼贫血（FA）、先天性角化不良（DC）、先天性红细胞生成异常性贫血（CDA）等均为罕见的先天性造血衰竭性疾病，常因临床表现不典型或者各疾病类型之间临床表现重叠，且现有实验室检查不具有特异性，诊断上存在挑战。致病基因检测是诊断这类疾病的重要环节。传统的Sanger测序对于有明确致病基因位点的单基因疾病的致病基因检测非常经济和高效，但难以完成没有明确候选基因或候选基因数量较多的疾病的基因诊断。而靶向二代基因测序（NGS）具有通量大、精确度高和信息量丰富等优点，可以在短时间内对感兴趣的基因进行精确定位。国外已有研究者尝试将NGS技术用于先天性贫血的诊断[1,2,3]，而国内尚未见相关报道。本研究中，我们对46例临床疑诊先天性贫血患者应用NGS进行了致病基因检测，旨在评估NGS在先天性贫血诊断中的应用价值。
对2014年8月至2017年7月在中国医学科学院血液病医院贫血诊疗中心连续就诊的贫血患者进行筛查，经详细的病史采集（包括家族史）、体格检查和实验室检查而未能明确诊断，参照文献[3,4,5,6,7]标准怀疑诊断"先天性贫血"者被纳入本研究。纳入流程见图1。在患者本人或者其监护人知情同意下采取外周血标本。
采集患者外周血标本5 ml，EDTA抗凝，应用血液基因组DNA提取试剂盒（lot#MI218，北京天根生化科技有限公司产品）提取DNA 3~5 μg。设计先天性贫血性疾病相关基因列表Blood Disease Hospital Anemia Panel 2014（BDHAP-2014），该基因组合（panel）未申请专利或参加临床试验。BDHAP-2014包含217个先天性贫血致病基因的全部外显子及剪接位点目标序列捕获探针（表1）。将提取的DNA用超声波打断并制备DNA文库，通过捕获芯片对217个基因的外显子及其临近的内含子区域的DNA进行富集，用通用引物对捕获的序列进行PCR扩增，最后应用Illumina Hiseq测序平台对扩增产物进行NGS（由迈基诺基因科技公司完成），以检测上述目标基因的潜在突变。靶向区域平均基因覆盖度98.46%，平均测序深度为436.75×，90.14%的靶向区域覆盖度>30×，60.29%的靶向区域覆盖度>200×。将测序结果与dbSNP数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP）、HGMD数据库（http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php）及千人基因组数据库进行比对。
BDHAP-2014基因组合
BDHAP-2014基因组合
| 疾病 | 基因数量 | 基因 |
|---|---|---|
| 范可尼贫血 | 16 | FANCA、FANCB、FANCC、FANCD1（BRCA2）、FANCD2、FANCE、FNACF、FANCG（XRCC9）、FANCI、FANCJ（BACH1/BRIP1）、FANCL、FANCM、FANCN（PALB2）、FANCO（RAD51C）、FANCP （SLX4）、FANCQ（ERCC4） |
| 先天性角化不良症 | 10 | DKC1、TERC、TERT、TINF2、NOP10、WRAP53、CTC1、RTEL1、TCAB1 |
| Diamond-Blackfan贫血 | 23 | RPS19、RPL5、RPL11、RPL26、RPL35A、RPS7、RPS10、RPS17、RPS24、RPS26、RPL3、RPL7、RPL9、RPL14、RPL15、RPL19、RPL23A、RPL25、RPL35、RPL36、RPS8、RPS15、RPS27A |
| Shwachman-Diamond综合征 | 1 | SBDS |
| 先天性红细胞生成异常性贫血 | 5 | CDAN1、SEC23B、KIF23、KLF1、GATA-1 |
| 遗传性血小板减少症 | 17 | MPL、THPO、GATA1、GATA2、RUNX1、FLI1、TAL1/SCL、Jak2、HOXA11、ALAS1、BCL2L1、NFE2、GP1BB、GP9、FOG1、ETS、ANKRD26 |
| 血小板减少-桡骨缺失综合征 | 1 | RBM8A |
| 周期性与先天性粒细胞缺乏 | 13 | ELANE（ELA-2）、HAX1、CXCR4、WAS、SBDS、GFI1、G6PC3、GATA2、YPS45、GCSF3R、SLC45A2、TAZ、AP3B1 |
| 红细胞膜疾病 | 23 | ANK1、SLC4A1、SPTB、SPTA1、EPB42、RhAG、PIEZO1、EPB49、MPP1、EPB72、GYPA、RHD/RHCE、KEL、XK、GYRC、DARC、SLC14A1、LU、ICAM-4、CD151、AQP1、AQP3 |
| 红细胞酶缺陷 | 12 | ADA、AK、PFK、PGK、G6PD、GPI、GSR、GSS、HK、NT5C3A、PKLR、TPI1 |
| 先天性铁粒幼细胞贫血 | 11 | ALAS2、SLC25A38、GLRX5、ABCB7、PUS1、SLC19A2、GATA1、FECH、UROS、UROD、CPOX |
| 铁代谢相关疾患 | 67 | DNMT1/SLC11A2、DcytB（Cybrd1）、SLC46A1、HOX1、Transferrin、Ferroportin、Hephaeatin、Ceruloplasmin、TfR1、TfR2、Mfrn1/SLC25A37、ABCB10、Mfrn2/SLC25A28、ALAS2、GLRX5、ABCB7、NRAMP1、Hepcidin、Jak2、HFE、Hemojuvelin、GDF11、GDF15、TWSG1、IL1、IL6、TMPRSS6、BMP2、BMP4、BMP6、Alk2、Alk3、ACTRIIA、Neogenin、HIF1、HIF2、EPO、CREBH、CHOP、C/EBPalpha、EXOC6、ZIP14、SLC22A17、Scara5、TIM-2、SLC48A1、Haptoglobin、Hemopexin、PCBP1、TRP1、IRP2、ACO2、CDC14A、HAO1、CDC42BPA、FBXL5、STEAP3、HO- 1、CUBN、HRG-1、LVDCC、Len2、Ferritin、FLVCR、SMAD4、HCP1、ERFE |
| 遗传性噬血细胞综合征 | 18 | ITK、CD27、MAGT1、PRF1、UNC13D、STX11、STXBP2、RAB27A、LYST、AP3B1、SH2D1A、BIRC4、FAS、FASLG、CASP10、TNFRSF1A、ITPKC、HPLH1 |
在确定先证者的致病基因型后，对先证者及其父母的外周血DNA进行Sanger测序（由北京迈基诺基因科技公司完成）。将检测结果与人类基因突变数据库（HGMD）比对。
应用MutationTaster和PolyPhen-2软件分别对基因突变位点进行危害性分析，预测基因突变对蛋白质功能的影响。仅当两种软件均预测同一突变对蛋白功能影响较大时，才认定该突变具有较强的危害性。
依据突变危害性的预测结果，将检出较强危害性的基因突变拟为致病性突变，确定为致病性突变须同时满足：①临床特征符合拟为致病性突变的相应疾病；②如果突变属于文献或专业数据库已报道的致病性突变，则确定为致病性突变；如果不属于已知致病性突变，突变类型为剪接突变、无义突变、移码突变、小片段缺失或发生于关键结构域的高度保守区的错义突变，参照数据库排除是高频突变或已知单核苷酸多态性（SNP），确定为致病性突变。拟为致病性突变者，对先证者及其父母的外周血DNA进行Sanger测序验证。
共46例患者纳入本组研究。≤14岁者19例（41.3%），中位年龄7（2~14）岁，男16例，女3例，临床分别疑诊为FA（9例），CDA（1例），先天性铁粒幼红细胞性贫血（CSA）（2例），先天性溶血性贫血（CHA）（3例），铁剂难治性缺铁性贫血（IR-IDA）（2例），未明原因的血细胞减少（Uc）（2例）。>14岁者27例（58.7%），中位年龄24（15~57）岁，男14例，女13例，临床疑诊分别为FA（2例），CDA（7例），CSA（4例），CHA（9例），IR-IDA（2例），DC（1例），Uc（2例）。
28例（60.9%）患者检出与临床疑诊贫血疾病相关的基因突变，结合临床特征及基因检测结果明确了诊断。突变累及12个基因，共44种突变（表2）。本研究检测到的11种（22.4%）基因突变与文献[8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18]报道一致，其余33种突变属于新发突变。其中26例患者的基因学结果与临床疑诊相符，一致率达56.5%，病种主要为FA（5/11，45.5%）、CSA（6/6，100.0%）、CDA（3/8，37.5%）及CHA（12/12，100.0%）。2例患者基因学结果不支持临床疑诊，经重新评估病情，依据基因学结果纠正了诊断，包括1例DC（疑诊FA）和1例家族性噬血细胞性淋巴组织细胞增生症（FHL）（疑诊Uc）；12例疑诊CHA患者也被明确诊断为CHA，且根据NGS结果确定了溶血的类型，包括遗传性口型红细胞增多症（4例），遗传性椭圆形红细胞增多症（1例）、腺苷激酶缺乏症（1例）、丙酮酸激酶缺乏症（5例）、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症（1例）。
28例疑诊先天性贫血患者靶向二代测序（NGS）检出的致病基因突变类型
28例疑诊先天性贫血患者靶向二代测序（NGS）检出的致病基因突变类型
| 例号 | 性别 | 年龄（岁） | NGS后确诊 | 突变基因及类型 |
|---|---|---|---|---|
| 1 | 男 | 2.5 | FA | FANCA：c.3935-1G>C剪接突变，c.2941T>C错义突变 |
| 2 | 男 | 24 | FA | FANCC：c.997-2 A>G剪接突变 |
| 3 | 男 | 7 | FA | FANCA：IVS33+1 C>T剪接突变，IVS28+1C>T剪接突变 |
| 4 | 男 | 7 | FA | FANCI：c.1893 A>C错义突变 |
| 5 | 男 | 6 | FA | FANCA：c.2358_2368del小片段缺失，c.2678G>A无义突变 |
| 6 | 男 | 4 | DC | TERT：c.838G>A[8]错义突变 |
| 7 | 男 | 20 | CSA | ALAS2：c.500G>A[9]错义突变 |
| 8 | 男 | 26 | CSA | ALAS2：c.823+5G>A错义突变 |
| 9 | 男 | 18 | CSA | STEAP3：c.*27 G>A UTR突变 |
| 10 | 男 | 7 | CSA | ALAS2：c.1231C>T[10]错义突变 |
| 11 | 男 | 5 | CSA | STEAP3：c.376C>T错义突变，c.869G>A错义突变 |
| 12 | 男 | 31 | CSA | ALAS2：c.1354C>T[11]错义突变 |
| 13 | 男 | 15 | CDA 2型 | SEC23B：c.1454C>G错义突变，c.1504G>C错义突变 |
| 14 | 女 | 38 | CDA 2型 | SEC23B：c.1831C>T错义突变，c.1727T>C错义突变 |
| 15 | 女 | 33 | CDA 2型 | SEC23B：c.74C>A错义突变，IVS4-1G>A剪接突变 |
| 16 | 男 | 24 | DHS | PIEZO1：c.2005 G>T错义突变 |
| 17 | 女 | 34 | DHS | PIEZO1：c.7488_7489insCTGGAG[12]同义突变，c.7219G>A错义突变，c.4018C>T错义突变 |
| 18 | 男 | 35 | DHS | PIEZO1：c.2005 G>T错义突变 |
| 19 | 男 | 9 | DHS | PIEZO1：c.7150G>A错义突变 |
| 20 | 男 | 8 | AKD | AK1：c.207+1G>A剪接突变 |
| 21 | 男 | 4 | PKD | PKLR：c.1085delT移码突变，c.1178A>G[13]错义突变 |
| 22 | 女 | 39 | PKD | PKLR：c.1219G>A[14]错义突变，c.966G>T错义突变，c.805G>T错义突变 |
| 23 | 男 | 18 | PKD | PKLR：c.1607G>A错义突变，c.787G>A[15]错义突变，c.783G>C错义突变 |
| 24 | 女 | 18 | PKD | PKLR：c.1468C>T[16]错义突变，c.724_733del移码突变 |
| 25 | 女 | 16 | PKD | PKLR：c.1492C>T[17]错义突变，c.811G>T错义突变 |
| 26 | 男 | 17 | G6PD | G6PD：c.1268G>A[18]错义突变 |
| 27 | 男 | 24 | HE | EPB41：c.221C>T错义突变 |
| 28 | 女 | 9 | FHL | UNC13D：c.743T>C错义突变，c.842A>C错义突变 |
注：FA：范可尼贫血；DC：先天性角化不良；CSA：先天性铁粒幼细胞贫血；CDA：先天性红细胞生成异常性贫血；DHS：遗传性口型红细胞增多症；AKD：腺苷激酶缺乏症；PKD：丙酮酸激酶缺乏症；G6PD：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症；HE：遗传性椭圆形红细胞增多症；FHL：家族性噬血细胞性淋巴组织细胞增生症
11例疑诊FA的患者中，5例确诊FA。另5例临床表现符合FA的临床特征，均为自幼出现的骨髓衰竭和身材矮小，合并躯体畸形或类似家族史，丝裂霉素C诱导的染色体脆性试验（MMC试验）均提示染色体脆性显著增高，但靶向NGS仅检出FA责任致病基因的单个等位基因杂合突变，不符合隐性遗传规律，暂未能确诊为FA。1例疑诊FA患者经基因检测后明确为DC。
6例疑诊CSA的患者均明确诊断为CSA。其中例8、例9、例11的突变属于新发突变，临床均表现为自幼出现的小细胞低色素性贫血、铁过载、无效造血、骨髓环形铁粒幼红细胞显著增多，临床表现典型，软件预测新发突变的危害性较强，特别是例9的非编码区突变可能影响蛋白翻译。
8例疑诊CDA的患者，3例确定诊断为CDA，均为SEC23B基因的复合杂合突变，软件预测突变的危害性较强。临床均为自出生即出现黄疸和贫血，长期为轻度贫血，肝脾肿大，无效造血、铁过载，骨髓形态学提示单纯红系比例显著增高，双核的红细胞占有核红细胞的10%以上，透射电镜下可见特征性的有核红细胞"双侧膜"结构，可以确诊CDA-2型。
12例确诊CHA的患者，临床上均表现为自幼年发病的溶血性贫血，经NGS检测，基因结果符合相应疾病的致病基因和遗传模式，结合突变危害性预测结果确定检出突变为致病性突变，明确了先天性溶血的诊断，且进一步明确了先天性溶血的类型。
例6确诊DC，具备骨髓衰竭的临床特征，基因突变类型为TERT基因的单等位基因的杂合突变，是文献报道过的已知致病性突变；例28确诊FHL，其突变为UNC13D基因的复合杂合突变，属于新发突变，两个杂合突变均引起编码的Munc13-4蛋白的C2A结构域改变，突变危害性预测均为较强的危害性，结合临床特征：反复发热（体温最高可达39 ℃），脾脏重度肿大，全血细胞减少，纤维蛋白显著减低，甘油三酯、血清铁蛋白和可溶性IL-2受体显著增高（高于诊断标准），确定为致病性突变，确诊FHL。
另有18例（39.1%）患者未发现基因突变，未明确诊断，包括疑诊FA 5例，疑诊CDA 5例、疑诊IR-IDA 4例、疑诊Uc 3例、疑诊DC 1例。
基因检测历来是精准诊断罕见先天性贫血的重要步骤。靶向NGS敏感、精确、经济、及时，可以自行设定兴趣基因谱的广度，而且能保证对兴趣基因的足够的覆盖深度[19]，用于临床诊断先天性贫血具备很大优势。在诊断先天性贫血时，NGS可免除许多繁杂的、高条件要求的特殊试验，如诊断FA的FANCD泛素化试验、基因互补试验及诊断CDA的透射电镜检查等；也不同于红细胞酶活性检测等，NGS不受血制品输注的影响，不受病毒感染、再障危象等并发症的影响，临床实用性更好。
Ghemlas等[2]通过靶向NGS明确44例（59%）原考虑已分类的遗传性骨髓衰竭综合征（IBMFS）和15例（18%）原考虑未分类的IBMFS的诊断，并直接明确了这44例已分类IBMFS的疾病亚型（共计24种）；共检出77种致病性突变，其中44种为已知致病性突变，28种为新发突变。Roy等[20]应用靶向NGS诊断出22例（38.6%）先天性贫血，其中17例确认了临床怀疑诊断，5例纠正了临床怀疑诊断；共检出32种致病性突变，其中16种为新发突变。我们的结果与上述研究一致。展现了靶向NGS在诊断先天性贫血方面的优势。
在本研究中，有18例患者经NGS检查后没有找到相应的致病基因，未能确诊。考虑其原因，一方面是NGS技术自身的局限，包括：①不充分的靶向覆盖（0~1.5%），且某些致病基因尚未纳入Panel中；②调控区及部分内含子区存在的致病性变异无法检出；③为保证数据分析的精确性，目标区域内少部分测序质量过低的变异方法学设定被滤掉；④虽然靶向NGS可以分析到小片段缺失/插入变异，但无法检出大片段缺失、拷贝数变异和短串联重复序列。另一方面，是对疾病认知水平的局限。生物信息技术的基础是对已知致病基因的认识，技术水平也受限于此，目前尚不足以鉴定某罕见突变是否属于致病性突变和（或）对已知致病基因的认识不充分。最后也不排除部分患者为非遗传性的贫血。及时更新NGS的panel，将最新获知的疾病基因纳入NGS检测是必要的。
我们的研究中>14岁患者超过半数，病种以CDA、CSA和CHA为主。说明先天性贫血的诊断易被延误。究其原因：（1）先天性贫血的诊断难度本身较大。由于先天性疾病多属罕见病，发病机制复杂，临床异质性强，不易被关注和识别，尤其缺乏先天性躯体畸形等特征的患者，更不易及时诊断。（2）繁琐的诊断流程和地区间医疗条件的不平衡制约了诊断的效率。（3）现有的检查手段存在较大局限性。因此高效、精准的NGS检查手段在这类疑诊先天性血细胞减少患者的诊断中更显重要。
DHS的致病基因PIEZO1和KCNN4已先后被鉴定[21,22]，随着研究的深入，基因型与临床型的关系将有助于临床诊断DHS。我们的靶向NGS检出了33种致病基因突变，其中有许多尚未报道，丰富了基因数据库内容。这些突变的生物学意义和致病性尚不明确，还需要进一步研究相关蛋白表达等，以确定基因突变对携带者的影响，以及与其他基因、临床表型的相互关系，这也为评估疾病预后提供参考。
总之，靶向NGS对于诊断疑诊先天性贫血患者可简化诊断流程，提高诊出效率，并且精准、经济、快速，具有重要的诊断价值。将来随着不断优化的靶向NGS的panel，以及更多致病基因的详细研究，靶向NGS在疑诊先天性贫血的诊断中会越来越广泛应用。
