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凝血因子Ⅻ（FⅫ）是由肝细胞合成的糖蛋白，其基因位于5q33-qter，包括13个内含子和14个外显子。未成熟FⅫ由615个氨基酸组成，成熟酶原型FⅫ由596个氨基酸残基组成，包括由二硫键连接的重链和轻链，重链含353个氨基酸残基，包括6个结构域；轻链是由243个氨基酸残基构成的催化域[1]。遗传性FⅫ缺陷症是一种罕见的常染色体隐性遗传病[2]，据人类基因突变数据库（HGMD）显示目前发现FⅫ基因突变约40余种，包括错义突变、无义突变及小的缺失或插入等。本研究对一个近亲婚配遗传性FⅫ缺陷症家系的临床表型和基因进行分析。
先证者，女，23岁，2011年8月因"右侧腹股沟淋巴结肿大"来我院就诊，行淋巴结活检术，病理示（右腹股沟）淋巴结血管免疫母细胞T细胞淋巴瘤，诊断为"淋巴结血管免疫母细胞T细胞淋巴瘤Ⅰ期"收住入院。凝血检查示活化部分凝血活酶时间（APTT）126.5 s（参考区间30.0~45.0 s），血浆凝血酶原时间（PT）13.1 s（参考区间12.00~15.00 s），既往无出血表现，肝肾功能检查结果均显示正常。APTT血浆混合试验能明显纠正，排除获得性的FⅫ缺乏。无使用抗凝和抗血栓药物史。其父母为姑表近亲婚配，家系成员均无出血症状。
健康体检者100名，男女各半，中位年龄32（18~50）岁，无肝肾疾病，无出血或血栓史，无抗凝和抗血栓用药史。
征得患者及家系成员知情同意及医院伦理委员会批准后采集患者静脉血2份（0.109 mol/L枸橼酸钠1∶9抗凝），一份3 000 r/min离心10 min取血浆作凝血指标检测，另一份全血冻存于－40 ℃待基因分析。
应用法国STAGO全自动血凝仪检测PT、APTT、纤维蛋白原（FIB）及凝血因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ、Ⅻ促凝活性（FⅧ∶C、FⅨ∶C、FⅪ∶C、FⅫ∶C）。使用ASSAYPRO公司提供的ELISA试剂盒检测FⅫ抗原（FⅫ∶Ag）。
爱思进生物技术（杭州）有限公司提供基因组提取试剂盒，严格按操作说明书操作。
根据FⅫ基因序列（GenBank AF538691），用primer5.0软件设计7对引物，覆盖FⅫ基因的所有外显子、内含子及侧翼序列，引物序列、扩增产物长度及退火温度见表1。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
凝血因子Ⅻ基因分析引物序列、产物长度及退火温度
凝血因子Ⅻ基因分析引物序列、产物长度及退火温度
| 外显子 | 引物序列（5′→3′） | 产物长度（bp） | 退火温度（℃） | |
|---|---|---|---|---|
| 上游引物 | 下游引物 | |||
| 1+2 | AGGGCAGCTTGACCAATC | GAGGAGCCAGGCCACTTA | 594 | 60 |
| 3+4 | GTGCCTGAGCAGTTGAGT | AGTAATGAGGCGGGAGGA | 437 | 58 |
| 5+6 | CTGCTCTTCCTTCCACCAT | CCGTTCCCAACCATCTGC | 434 | 60 |
| 7+8 | CACTGCGTTCCCTCCCCAAG | CGTTAGAGCGCCGGGAG | 600 | 58 |
| 9+10 | CCGTCGTGTGGCTACAGGA | CTCTGGGCGGGCGGGTA | 594 | 58 |
| 11+12 | GGGCTTCCCCAGAACGCTT | TCTTCCGCCTAACCCAGTG | 493 | 58 |
| 13+14 | GCGGCAAGCGTTGTCAGA | GCGGGACCCATGAAGAAA | 639 | 58 |
PCR试剂为2×Taq PCR MasterMix（含染料），反应体系为50 μl，包括上下游引物各1 μl、DNA模版3 μl、Taq PCR MasterMix 25 μl和双蒸水20 μl。用10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物。
由上海桑尼生物工程有限公司纯化测序PCR产物。测序结果与美国NCBI公布的FⅫ基因序列（GenBank KP123628.1）比对，发现基因突变序列。
用MegAlign软件分析突变氨基酸的保守性。
采用PYMOL软件模拟突变FⅫ蛋白结构，预测突变对FⅫ蛋白构象的影响。
先证者PT正常，APTT明显延长，FⅫ∶C和FⅫ∶Ag显著降低，FⅧ∶C略有升高，其他指标未见明显异常。其他家系成员FⅫ∶C和FⅫ∶Ag略有下降，其余指标均在正常范围内（表2）。
凝血指标检测结果
凝血指标检测结果
| 家系成员 | PT（s） | APTT（s） | FIB（g/L） | FⅧ∶C（%） | FⅨ∶C（%） | FⅪ∶C（%） | FⅫ∶C（%） | FⅫ∶Ag（%） |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 父亲 | 14.1 | 36.0 | 2.6 | 98 | 71 | 94 | 54 | 67 |
| 母亲 | 12.8 | 36.2 | 4.2 | 85 | 113 | 86 | 60 | 73 |
| 先证者 | 13.1 | 126.5 | 3.2 | 187 | 101 | 70 | 2 | 6 |
| 参考区间 | 11.2～14.3 | 27.0～41.0 | 2.0～4.0 | 78～128 | 68～128 | 82～118 | 72～113 | 72～113 |
注：PT：凝血酶原时间；APTT：活化部分凝血酶时间；FIB：纤维蛋白原；FⅧ∶C、FⅨ∶C、FⅪ∶C、FⅫ∶C：凝血因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ、Ⅻ促凝活性；FⅫ∶Ag：凝血因子Ⅻ抗原
先证者FⅫ基因13号外显子区发现纯合突变g.8603T>C（p.Cys559Arg）。100例正常对照组未发现此突变，美国国立生物技术信息中心SNP数据库中未出现该位点的多态性，排除基因多态性。经HGMD数据库分析为新的突变。父母均为g.8603T>C杂合突变。见图1。
A：先证者父母第13外显子g.8603T>C杂合突变；B：先证者第13外显子g.8603T>C纯合突变；C：野生型
本研究发现的g.8603T>C（p. Cys559Arg）为错义突变。将人类和其他哺乳动物（家鼠、野猪、北极熊、苏门答腊猩猩、野骆驼）的FⅫ进行同源蛋白序列比对，发现559位及其周围氨基酸序列在这些动物间高度保守。见图2。
PYMOL软件分析显示p.Cys559Arg致559位和590位的二硫键断裂，且FⅫ蛋白二级结构有如下改变（图3）：77~80位氨基酸（PNFD），94~97位氨基酸（VKD），296~299位氨基酸（QTPT），343~346位氨基酸（AKRE）和454~456位氨基酸（SPV）形成新的α螺旋结构；564~570位氨基酸（GGPLVCE）β-折叠变成564~571位氨基酸（GGPLVCED）β-折叠。
A：正常FⅫ蛋白结构；B：p.Cys559Arg突变后突变FⅫ蛋白结构[白色箭头所示：1、2、3、4、5依次为77~80位氨基酸（PNFD），94~97位氨基酸（VKD），296~299位氨基酸（QTPT），343~346位氨基酸（AKRE）和454~456位氨基酸（SPV）形成的新的α螺旋结构，6为564~571位氨基酸（GGPLVCED）形成的β-折叠]；C：正常FⅫ蛋白559位半胱氨酸和590位半胱氨酸形成二硫键（白色箭头所示）；D：p.Cys559Arg后559位与590位的二硫键消失
生理情况下，血管损伤时释放组织因子，形成组织因子-凝血因子Ⅶ复合物启动外源凝血途径，同时此复合物也激活FⅨ而启动内源凝血途径。而体外检测APTT，由白陶土、硅藻土等激活剂激活FⅫ启动内源凝血途径。若患者FⅫ缺乏、APTT明显延长而无明显出血倾向，表明FⅫ参与的凝血途径在生理性止血过程中并不重要。本家系先证者缺乏FⅫ，也无出血倾向，仅实验室检查示APTT明显延长、FⅫ∶C和FⅫ∶Ag明显降低，其他凝血指标未见明显异常。患者虽诊断为"淋巴结血管免疫母细胞T细胞淋巴瘤"，但APTT血浆混合试验能明显纠正，故排除抑制物引起的FⅫ缺乏。因此FⅫ∶C和FⅫ∶Ag降低是该患者APTT延长的主要原因。
遗传性FⅫ缺陷症是常染色体隐性遗传病，极少数表现为显性遗传，本研究中先证者父母为近亲婚配，均为g.8603T>C突变基因的携带者，血浆FⅫ∶C和FⅫ∶Ag下降不明显。先证者为g.8603T>C纯合子，其血浆FⅫ∶C和FⅫ∶Ag显著下降。据Miyata等[3]报道，590位（成熟FⅫ的571位）半胱氨酸被替换为丝氨酸，破坏该位与559位半胱氨酸间的二硫键，影响了FⅫ蛋白的催化功能和活性。而本研究发现的g.8603T>C造成p.Cys559Arg，同样使559位和590位半胱氨酸未能形成二硫键，有力佐证g.8603T>C纯合突变是先证者患FⅫ缺陷症的遗传性因素。
本例患者g.8603T>C（p.Cys559Arg）突变使559位半胱氨酸变成精氨酸，精氨酸为碱性氨基酸，半胱氨酸为中性氨基酸，且精氨酸分子明显大于半胱氨酸，这可能影响FⅫ蛋白559位周围基团的带电情况和分子间距。经PYMOL软件分析，示p.Cys559Arg不仅影响559位和590位半胱氨酸二硫键的形成，同时在FⅫ蛋白功能区多处形成α螺旋结构和β-折叠改变了蛋白的二级结构。成熟酶原型FⅫ由596个氨基酸组成，1~353位氨基酸组成重链，含6个结构域，依次为纤维连接素Ⅱ型结构域（1~88位）、上皮生长因子样结构域（94~131位）、纤维连接素Ⅰ型结构域（133~173位）、上皮生长因子样结构域（174~210位）、Kringle结构域（215~295位）和富脯氨酸部位（296~349位）。354~596位构成轻链（催化区）[4]，394位组氨酸、442位天冬氨酸和544位丝氨酸组成其活性部位。突变蛋白结构预测分析示p.Cys559Arg导致轻链活性部位周围结构改变，及重链中多处结构域结构的改变。这些蛋白二级结构的改变发生在纤维连接素Ⅱ型结构域，上皮生长因子样结构域和富脯氨酸部位，可能影响FⅫ蛋白与Zn2+的结合，及其催化能力。不同物种间FⅫ同源性比对结果显示559位氨基酸高度保守，说明它可能与FⅫ的功能密切相关。加之先证者的FⅫ∶C和FⅫ∶Ag同时下降，说明g.8603T>C（p.Cys559Arg）可能对FⅫ蛋白的功能和代谢均造成影响。
HGMD资料显示，轻链突变在已发现的40余种FⅫ基因突变中超过半数，其中550~590位氨基酸的突变较多见，该区域的基因突变均与FⅫ缺陷症有关[5,6,7]，这与同源性比对示该区域多为高度保守序列的结果相符。本例患者检出的g.8603T>C（p.Cys559Arg）为首次报道，可能是血浆FⅫ∶C和FⅫ∶Ag明显下降的主要原因。但突变蛋白结构、功能和代谢过程的具体改变以及其临床意义有待进一步研究分析。
