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随着诊疗模式改进，B细胞淋巴瘤缓解率有了很大提高，但是仍有部分复发难治性患者因为存在肿瘤耐药等原因无法获得缓解[1]。CAR-T细胞疗法是近年来极具前景的肿瘤过继免疫细胞治疗方法[2,3,4]。程序性死亡受体1（PD-1）及其配体PD-L1信号通路在削弱抗肿瘤免疫应答方面发挥重要作用[5,6]，靶向这一途径的检查点治疗如PD-1抗体Nivolumab、Pembrolizumab及PD-L1抗体BMS-936559、MEDI4736已取得突破性进展[7,8]。现将我中心采用靶向CD19的CAR-T细胞（CAR-T19细胞）联合减低剂量PD-1抑制剂治疗PD-1高表达B细胞淋巴瘤患者的临床疗效总结如下，同时附相关体外实验结果并文献复习。
患者，女，70岁，因"低热、腰痛、乏力10 d"于2017年7月就诊。骨髓活检病理示小B细胞淋巴瘤侵犯骨髓。FISH检测示IgH-BCL2阳性率4.8%。MYD88基因检测阴性。PET-CT：多发骨质密度不均匀，部分骨质破坏，代谢异常增高（L3椎体局部SUVmax=28.20）；颈部双侧、右侧锁骨上窝多发增大淋巴结，代谢异常增高（SUVmax=8.59）；L2-3间盘水平腹腔左侧肠系膜区软组织肿块，代谢异常增高（SUVmax=8.57）。临床诊断：滤泡淋巴瘤Ⅳ期B组。予以2个疗程FC（氟达拉滨25 mg/m2×3 d+环磷酰胺250 mg/m2×3 d）方案、4个疗程R-CHOP（利妥昔单抗375 mg/m2+环磷酰胺750 mg/m2+表柔比星65 mg/m2+长春地辛3 mg/m2+泼尼松60 mg/m2×5 d）方案化疗；辅以唑来膦酸盐治疗。患者低热、腰痛、乏力缓解，逐渐出现间断腹痛症状。故复查PET-CT：原片所示的多发骨质高代谢灶代谢明显减低；原片颈部双侧及右侧锁骨上窝多发增大淋巴结、L2-3间盘水平腹腔左侧肠系膜区软组织肿块基本消失，代谢较前明显减低；L1-5水平肠系膜密度不均匀增高，范围较前增大，代谢不均匀异常增高（SUVmax=6.70），考虑淋巴瘤浸润。
患者未同意进一步针对新发病灶进行病理活检，考虑原临床症状化疗后缓解，与影像学检查结果相符；但逐渐出现间断腹痛症状，且于化疗后稍有缓解，结合PET-CT结果，该新发病灶不除外仍为淋巴瘤病灶。综合患者年龄等情况，不适合加强化疗剂量治疗，故于2018年1月入组CAR-T19细胞临床试验（ChiCTR-ONN-16009862）。患者外周血PD-1阳性表达率68.4%。预处理方案为FC方案，CAR-T19细胞输注量1.3×107/kg，CAR-T19细胞输注次日给予PD-1抑制剂纳武单抗（Nivolumab）（美国百时美施贵宝公司产品）100 mg（1.5 mg/kg）。
第三代CD19质粒购自美国Creative Biolabs公司，采用Lenti-Pac慢病毒颗粒包装试剂盒（上海伯易生物科技有限公司产品）包装慢病毒，转染48 h后收集病毒颗粒。PD-1高表达的患者外周血T细胞，作为本实验CAR-T19细胞培养的T细胞来源。采用磁珠分选试剂盒（德国美天旎生物技术有限公司产品）富集CD3+ T细胞。获得的细胞用含有IL-2、谷氨酰胺的T细胞专用培养基培养，第4天接种上述慢病毒。培养第12天收获CAR-T19细胞。采用流式细胞术检测CAR-T19细胞转染率。
实验分组：①未治疗细胞组：PD-1高表达患者来源CAR-T19细胞；②治疗细胞组：PD-1高表达患者来源CAR-T19细胞联合不同剂量的Nivolumab，终浓度分别为72、36、18 μg/ml（分别为依据该患者体重计算的临床建议剂量、1/2和1/4临床建议剂量），培养第12天细胞收获时加入培养体系；③正常对照组：健康供者外周血来源CAR-T19细胞。
将收获的CAR-T19细胞与靶细胞Pfeiffer细胞（购自美国模式培养物集存库）共培养，采用CCK-8法（试剂盒购自日本同仁化学研究所）检测CAR-T19细胞增殖情况，采用LDH法（试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司）检测对Pfeiffer细胞的杀伤活性。按照试剂盒说明书进行操作，每组设3个复孔，实验重复3次。
采用SPSS17.0软件进行统计学分析。实验数据以
±s表示，采用单因素方差分析F检验及两样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
患者治疗过程中观察结果见表1。细胞因子释放综合征（CRS）：Ⅱ级，不良反应轻微可耐受。治疗后60 d，患者腹痛症状逐渐消失、病情稳定。复查PET-CT：L1-5水平肠系膜密度不均匀增高灶，边缘模糊，SUVmax 6.36，较前范围缩小。随访至CAR-T19细胞治疗后150 d，患者病情稳定，外周血PD-1阳性表达率0.68%，CAR-T19细胞阳性表达率0.06%，仍在进一步观察中。患者初诊、化疗后及CAR-T19细胞治疗后PET-CT检查结果见图1。
患者接受CAR-T19细胞治疗过程中观察记录
患者接受CAR-T19细胞治疗过程中观察记录
| 观察指标 | －12 d | 0d | +4 d | +7 d | +14 d | +21 d |
|---|---|---|---|---|---|---|
| PD-1表达(%) | 80.90 | 80.76 | 未测 | 0.05 | 0.02 | 0.59 |
| 体温（℃） | 36.7 | 39.0 | 38.6 | 36.8 | 36.4 | 36.5 |
| 寒战 | 无 | 有（2次） | 无 | 无 | 无 | 无 |
| 血压(mmHg) | 100/60 | 110/74 | 116/75 | 156/89 | 125/76 | 105/70 |
| 神经系统症状 | — | 头痛 | 头痛 | 无 | 无 | 无 |
| WBC(×109/L) | 4.27 | 2.37 | 1.04 | 4.01 | 2.55 | 5.16 |
| HGB(g/L) | 114 | 106 | 94 | 89 | 105 | 109 |
| PLT(×109/L) | 155 | 68 | 47 | 104 | 127 | 173 |
| IL-6(ng/L) | 3.3 | 4.8 | 110.2 | 65.5 | 5.8 | 3.0 |
| 铁蛋白(ng/ml) | 354 | 299 | 未测 | 1 035 | 962 | 885 |
| C反应蛋白(mg/L) | 20.4 | 18.5 | 92.5 | 61.7 | 30.4 | 18.4 |
| CAR-T19细胞(%) | — | — | 0.22 | 9.22 | 6.37 | 0.40 |
注：1 mmHg=0.133 kPa；—：不适用
①PD-1高表达患者CAR-T19细胞转染率与正常对照组相近（30.7%对33.3%）。②PD-1高表达患者CAR-T19细胞以及联合不同剂量Nivolumab的患者CAR-T19细胞增殖率与健康正常供者差异均无统计学意义（24 h：F=1.057，P>0.05；48 h：F=1.261，P>0.05）。③CAR-T19细胞联合Nivolumab（72 μg/ml和36 μg/ml），对Pfeiffer细胞的杀伤活性在48 h时与正常对照组相近，均高于未联合CAR-T19细胞组，差异有统计学意义（P值均<0.001）（图2），即36 μg/ml Nivolumab可以恢复PD-1高表达CAR-T19细胞的杀伤活性。
A：CAR-T19细胞增殖；B：对Pfeiffer细胞株杀伤活性
近年来，CAR-T19细胞在治疗B淋巴细胞恶性肿瘤方面显示出较好的疗效：治疗急性B淋巴细胞白血病完全缓解（CR）率在90%左右；慢性B淋巴细胞细胞白血病CR率60%左右[9]；弥漫大B细胞淋巴瘤CR率50%左右，有效率70%~80%[10,11]。但部分B细胞淋巴瘤患者对CAR-T细胞治疗效果不佳，原因之一是肿瘤微环境中存在的多种抑制分子及自身免疫抑制机制可能降低CAR-T细胞杀伤活性，其中T细胞高表达PD-1和肿瘤细胞高表达PD-L1是重要原因之一。
肿瘤细胞表达PD-L1与T细胞表面PD-1结合促进肿瘤的免疫逃逸并阻止T细胞进入肿瘤区域或诱导进入肿瘤区域的T细胞凋亡，进而削弱其治疗潜能[12,13]。在肿瘤特异性抗原刺激下，CAR-T细胞PD-1表达显著上调，减低其抗肿瘤免疫反应水平[14,15]。阻滞PD-1/PD-L1通路不仅可以增加T细胞数量，还可以通过增强细胞因子的分泌，减少Treg细胞和骨髓源性抑制细胞来改变抑制性的肿瘤微环境，从而增强T细胞抗肿瘤效果[16]。Xu-Monette等[17]报道抗PD-1抑制剂在复发难治性B细胞非霍奇金淋巴瘤中总反应率为35%，但持久性有限，大多数患者无法从中长期获益[18]。
基于T细胞的PD-1高表达，CAR-T细胞治疗与PD-1/PD-L1抑制剂联合应用，理论上可以同时解决CAR-T细胞疗效差与PD-1/PD-L1抑制剂疗效不持久的问题。Cherkassky等[19]在动物实验中发现，CAR-T细胞输注后30 d给予PD-1抑制剂，可获得肯定疗效。有研究者报道1例难治弥漫大B细胞淋巴瘤患者予以5.34×106/kg CAR-T19细胞治疗，26 d后因疾病进展予以PD-1抑制剂2 mg/kg治疗，获得较好临床反应[20]。以上结果提示PD-1抑制剂与CAR-T细胞联合使用理论上可行，可否在外周血PD-1高表达患者中，预期CAR-T19细胞治疗疗效不佳情况下，将二者同时使用，尚未见临床报道。
另外，CAR-T细胞治疗存在严重不良反应，如CRS、神经系统毒性等；以及因为插入突变继发第二肿瘤的风险[21]。而PD-1抑制剂可能导致免疫耐受失衡，免疫反应不受控制；进而引起临床上自身免疫性/自身炎症性疾病，对正常的器官系统和组织，如皮肤、胃肠、肝脏、肺、黏膜、皮肤和内分泌系统等造成间接伤害，甚至致死性心肌炎[22,23,24,25]。如果CAR-T细胞治疗与PD-1同时使用，其不良反应是影响临床疗效的重要因素。因此我们试图尝试减低剂量的PD-1抑制剂与CAR-T19细胞联合治疗，以减轻不良反应。
首先，我们选择该患者外周血PD-1高表达T细胞进行体外实验。结果显示：PD-1高表达CAR-T19细胞联合36 μg/ml Nivolumab对Pfeiffer细胞株杀伤活性，在48 h时与健康对照者CAR-T19细胞结果相近，均高于单用PD-1高表达的CAR-T19细胞。而联合36 μg/ml Nivolumab组在24 h的杀伤活性较低，可能与二者作用时间尚短有关；联合18 μg/ml Nivolumab组杀伤活性不稳定。证实了之前的设想，减低剂量的PD-1抑制剂与CAR-T19细胞联合治疗，体外实验可行。
此后，患者采用1.5 mg/kg的PD-1抑制剂与自体PD-1高表达的CAR-T19细胞联用。治疗过程当中患者耐受性良好，CRS反应Ⅱ级；治疗后60 d患者腹痛症状消失、疾病稳定，PET-CT检查示疾病缓解，获得满意临床疗效。治疗后150 d，患者病情仍稳定，且外周血PD-1表达率0.68%，表明PD-1表达持续受抑制。PD-1持续低表达的机理尚待进一步探讨。
综上，我们的初步结果表明，对于外周血T细胞PD-1高表达的复发/难治淋巴瘤患者，CAR-T19细胞治疗前，根据PD-1表达情况预计其有可能疗效不佳时，可选择联合应用1/2临床建议剂量的PD-1抑制剂，可同时解决CAR-T细胞疗效差、PD-1抑制剂疗效不持久的问题，降低二者的不良反应，为提高复发/难治淋巴瘤患者CAR-T细胞治疗的疗效提供了新的思路。
