对唇腭裂跨膜蛋白1样蛋白（CLPTM1L）的表达与肺癌细胞放射敏感性改变的相关性进行研究。
采用噻唑蓝（MTT）方法和细胞克隆形成实验检测细胞的生长和生存率；采用蛋白质印迹（Western Blot）方法检测蛋白表达水平。
不同肺癌细胞的放射敏感性与其细胞中CLPTM1L的蛋白表达水平呈负相关，CLPTM1L高表达的肺癌细胞表现出低放射敏感性；提高肺癌细胞中CLPTM1L的表达水平可明显降低γ射线辐照后细胞的放射敏感性，相反转染CLPTM1L小干扰RNA (siRNA）降低CLPTM1L表达水平则大大提高了肺癌细胞的放射治疗敏感性。
CLPTM1L可能是调节肺癌放射治疗敏感性的一种新靶向基因。
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肺癌已经成为我国大中城市中死亡率增长最快的癌症，也是我国首位恶性肿瘤死亡原因，而且发病年龄也呈逐渐年轻化的趋势[1]。根据病理类型，肺癌可分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌。肺癌中有80％为非小细胞肺癌，其包括鳞癌、腺癌及大细胞癌等。手术、放射治疗（简称放疗）、化学药物治疗（简称化疗）、分子靶向治疗和细胞免疫治疗是目前肺癌的主要治疗方法。放疗是使用高能量电离辐射所产生的射线对肿瘤局部进行照射，通过能量的释放阻止癌细胞生长和破坏癌细胞的正常功能，以达到使肿瘤生长阻滞、减小甚至消失的目的。在手术前使用放疗，能缩小癌肿瘤体积，方便手术切除，也可使不适合手术的患者重新赢得手术机会；在手术后给予放疗则可降低局部和区域淋巴结的复发率，以提高治愈率和生存率。而对于一些晚期无法手术的患者来说，放疗能缓解疼痛、减轻压迫症状、延长生命和提高生存质量[2]。立体定向消融的放疗可应用于治疗早期不能或不愿意手术的肺癌患者，临床试验表明，立体定向消融放疗治疗早期肺癌患者的1年生存率为94.7%，3年生存率为84.7% ，5年生存率为62%~72%[3]。因此，放疗是肺癌治疗中不可缺少的治疗手段。
然而，在放疗过程中，肺癌患者往往逐渐对放疗产生耐辐射性，对治疗越来越不敏感，因此需加大照射剂量，然而大剂量会给患者带来严重的不良反应和并发症，从而大大降低了患者的生存质量。因此，寻找造成肺癌耐辐射产生的机制，改变放射敏感性，调节相关基因的表达水平和功能，增加肺癌对放疗的敏感性，降低和减少治疗中对正常肺和其他组织造成的放射损伤，从而提升患者放疗的疗效，是目前肺癌放疗在临床和基础研究的热点。本研究旨在研究唇腭裂跨膜蛋白1样蛋白（cleft lip and palate transmembrane 1 like，CLPTM1L）的表达与肺癌细胞放射敏感性改变的相关性。
H2170、H23、SK-MES-1、NCI-H460、H441、HTB-58、A549共7种不同的人类肺癌细胞系和鼠肺癌Lewis细胞（美国Georgetown大学细胞服务中心），血清、青霉素、链霉素、DMEM培养基（美国Hyclone公司），DH5α感受态菌（天根生化科技（北京）有限公司），质粒抽提纯化试剂盒（日本Takara公司），Lipofectamine 2000（美国Invetrogene公司），二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），I抗（ab98239）（美国艾博抗公司），Ⅱ抗（sc-2030）（美国Santa Cruz公司），二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO ）、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS ）（美国Sigma公司），高炅敏度电化学发光（electrochemiluminescence, ELC）试剂盒（中国康为世纪生物科技有限公司）。
Thermo311 CO2培养箱（美国Thermo公司），USD Autocell40 137Cs辐照仪（加拿大原子能有限公司），InfiniteⒸ200 PRO NanoQuant酶标仪（瑞士Tecan公司）。
H2170、H23、SK-MES-1、NCI-H460、H441、HTB-58及A549共7种不同的人类肺癌细胞系和鼠肺癌Lewis细胞系均单层贴壁生长，并培养于含体积分数为10％血清、105 U/L青霉素、100 mg/L链霉素的DMEM培养基中。细胞置于体积分数为5% CO2、37 ℃培养箱内培养。照射实验1组为上述7种不同的人类肺癌细胞系；照射实验2组分别为H2170细胞转染CLPTM1L小干扰RNA （small interfering RNA, siRNA）或Control siRNA表达质粒、转染pcDNA3 CLPTM1L的A549细胞和pcDNA3表达质粒的A549细胞；照射实验3组分别为空白对照细胞、转染CLPTM1L siRNA的Lewis细胞、转染Control siRNA的Lewis细胞、转染pcDNA3 CLPTM1L的Lewis细胞和转染pcDNA3的Lewis细胞。所有实验组均采用137Cs辐照仪产生的γ射线（250 cGy/min）照射细胞。
DH5α感受态菌经质粒转化，用小量提取柱离心式质粒抽提纯化试剂盒提取质粒DNA。质粒DNA经酶切、琼脂糖凝胶电泳进行酶切鉴定。
照射后的细胞以3×104个/孔的密度接种于6孔细胞培养板中，培养20 h后，每孔加20 μl噻唑蓝（MTT），继续培养4 h；弃去培养基，加120 μl DMSO并振摇10 min。然后用酶标仪检测各组细胞在波长570 nm处的吸光度（OD）值（参考波长为450 nm ），以未加转染和未照射的细胞为对照组，其细胞存活率为100%，实验组的细胞存活率计算公式如下
实验2组的肺癌细胞分别接受0、2、4、6、8、10 Gy辐射照射后，按不同的照射剂量分别对应接种500、1 000、2 000、5 000、10 000、20 000的不同数量细胞到60 mm培养皿。细胞连续培养3周后用甲醇固定，加姬姆萨应用液染色30 min，流水洗净，计数细胞数≥50的克隆个数。
按Lipofectamine 2000转染说明书进行表达质粒细胞转染。转染前24 h将肺癌细胞种植于24孔培养板，待细胞生长至60%~70％时，将2 μg表达质粒和2 μl Lipofectamine 2000转染入细胞，并继续培养24 h。
收集实验1组和实验2组的细胞，离心，悬浮于裂解液中，并置冰上裂解细胞2 h, 10 000 r/min离心10 min，取上清液。采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，调整蛋白至相同浓度。样品加入等体积2×SDS加样缓冲液，沸水煮沸5 min，经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）后转膜；封闭液封闭2 h。加I抗，4 ℃孵育过夜；TBST洗3次，每次15 min；加相应的Ⅱ抗，室温孵育1 h, TBST洗3次，每次15 min；用ECL法检测蛋白表达。免疫印迹所用试剂（细胞裂解液、SDS加样缓冲液、封闭液、TBST）用法见文献[4]。
所有实验至少重复3次。采用SPSS19.0软件进行数据分析。对照组和各处理实验组结果均取自不同实验样本的均值，以平均值±标准差（
±s）表示。两组之间数据的比较采用双侧t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
采用5 Gy单剂量γ射线照射实验1组的7种人类肺癌细胞，照射后24 h采用MTT细胞增殖分析方法检测这些肺癌细胞的增殖情况。7种细胞放射敏感性从高到低的排列顺序分别为A549 >HTB-58>H23>H441 >SK-MES-1>NCI-H460>H2170（图1）。检测这些肺癌细胞中CLPTM1L表达水平的结果发现，CLPTM1L的表达水平在H2170细胞最高，其次为NCI-H460和SK-MES-1细胞，其他HTB-58、H23、H441和A549 4种细胞则非常低（图1）。实验结果表明，肺癌细胞的放射敏感性正好与其所含的CLPTM1L表达水平呈负相关；反之，高水平表达CLPTM1L的肺癌细胞，其受到辐射照射抑制细胞增殖的影响相对于低水平的CLPTM1L表达肺癌细胞要小。
CLPTM1L—唇腭裂跨膜蛋白1样蛋白；α-Actin—α-肌动蛋白
如图2所示，转染CLPTM1L siRNA到含有高CLPTM1L蛋白水平的H2170细胞中，明显降低了细胞中CLPTM1L蛋白的表达水平。细胞克隆形成实验结果表明，与Control siRNA转染后的H2170细胞（90%抑制率（IC90）对应6.8 Gy）相比，H2170/CLPTM1L siRNA细胞（IC90对应2.1 Gy）放射敏感性明显增加，差异有统计学意义（t=2.982，P=0.007 5）；而通过稳定转染法将pcDNA3 CLPTM1L表达质粒转染到含有低CLPTM1L表达水平的A549细胞，明显提高了细胞中CLPTM1L蛋白表达水平。细胞克隆形成实验结果表明，与转染对照pcDNA3 "空"质粒后的A549／对新霉素抗药（Neo）细胞（IC90对应3.6 Gy ）相比，转染有pcDNA3 CLPTM1L表达质粒的A549/CLPTM1L细胞（IC90对应8.4 Gy）放射敏感性明显下降，差异有统计学意义（t=3.235 ，P=0.002 7）。因此，改变这两种肺癌细胞中的CLPTM1L表达水平，无论是升高还是降低CLPTM1L表达水平，确实可调节肺癌细胞的放射敏感性，且两者呈负相关性。
CLPTM1L—唇腭裂跨膜蛋白1样蛋白；α-Actin—α-肌动蛋白；Parental—未转染的母细胞
相同实验方法的鼠肺癌Lewis细胞的实验结果表明，CLPTM1L同样也可调节Lewis鼠肺癌细胞的放射敏感性，增加CLPTM1L表达明显降低了细胞的放射敏感性；相反，降低其表达水平则提高了细胞的放射敏感性（图3）。这些研究结果非常清楚地表明，无论是在人肺癌细胞还是在鼠肺癌细胞中，人为地改变肺癌细胞中CLPTM1L的表达水平均可明显地影响肺癌细胞的放射敏感性。
CLPTM1L—唇腭裂跨膜蛋白1样蛋白
肺癌属于多基因疾病，即多个基因的变异共同参与发病。研究表明携带基因变异的个体比非携带者具有更高的患病风险，故将这些基因称为"易感基因" 。2011年来自南京医科大学、中国医学科学院北京协和医院等研究机构的科研人员通过全基因组关联研究（GWAS）对5 408名受试者（其中包括2 331例肺癌患者以及3 077名未患该病的对照个体）进行了全基因组关联分析，进一步对另一组12 722名受试者（其中包括6 313例肺癌患者以及6 409名对照个体）进行了检测，他们鉴定出了4个与汉族肺癌人群相关联的易感风险位点，即3q28、5p15.33、13q12.12和22q12.2[5]。其他研究也发现染色体5p15.33区域与肺癌的发生和发展密切相关[6,7]。染色体5p15.33区域存在两个已知的基因，分别是基因端粒酶逆转录酶（TERT）和CLPTM1L，这两个基因已经被发现与多种癌症的发展相关[8]。
CLPTM1L蛋白也称之为顺氯氨铂耐药相关蛋白（CRR9p或CRR9蛋白）[9,10]。该基因定位于染色体5p15.33，含有538个氨基酸，产生的蛋白产物的相对分子质量为62 ku；且人和鼠的蛋白均含有538个氨基酸，蛋白序列吻合度超过99%。目前全基因组关联研究揭示CLPTM1L基因单核苷酸多态性（如rs401681和rs402710）与肺癌、乳腺癌、胰腺癌、鼻咽癌、膀胱癌、卵巢癌、结肠癌、胃肠道间质瘤、慢性淋巴细胞白血病、子宫颈癌和家族性睾丸生殖细胞肿瘤等在内的多种肿瘤发生和发展有着密切关系，而且常常与端粒酶逆转录酶的单核苷酸多态性改变同时发生[11,12]；此外在临床肺癌患者组织细胞中，特别是在腺癌组织细胞中，CLPTM1L1表达水平比正常肺组织中的表达水平明显偏高[9]，但有关CLPTM1L在肿瘤中所起到的生物学功能和作用则鲜有报道。
本研究的实验结果证实：①不同肺癌细胞的放射敏感性与其细胞中CLPTM1L蛋白表达水平呈负相关，CLPTM1L高表达的肺癌细胞表现出低放射敏感性。②人为增加肺癌细胞中CLPTM1L的表达水平可明显降低其对γ射线辐照的放射敏感性，相反降低CLPTM1L表达水平则可大大提高肺癌细胞的放射治疗敏感性。这些实验结果为CLPTM1L与肺癌细胞的放射治疗敏感性存在密切关系提供了直接的证据。文献[13]也揭示CLPTM1L可降低肿瘤细胞对顺氯氨铂治疗的敏感性。
因此，采用体外培养的肺癌细胞模型和肺癌体内动物模型深入开展CLPTM1L基因在肺癌放射治疗中的作用和相关机制的研究，无疑将为提高肺癌放疗的疗效和针对性个体靶向基因的研究提供了新方向和新思路。因此，本研究在肺癌耐放射治疗的机制、临床肺癌患者放射治疗的个体化治疗以及放射治疗疗效评估的基础研究和临床应用研究均具有重要的意义和研究价值。
利益冲突 无
