探讨脐带间充质干细胞（UCMSCs）对颅脑创伤（TBI）大鼠受损脑组织的保护作用。
将30只健康Sprague-Dawley大鼠按随机数字表法分为正常对照组（不予任何处理）、模型组（TBI后注射生理盐水）和UCMSCs移植组（TBI后注射UCMSCs），每组10只。UCMSCs移植后第10天处死大鼠，用流式细胞术检测大鼠损伤区周围脑组织中UCMSCs的比例，苏木精-伊红（HE）染色观察损伤区周围脑组织的病理学改变，免疫组化及免疫荧光双染法检测损伤区周围脑组织中血管内皮生长因子（VEGF）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和脑源性神经营养因子（BDNF）的表达变化，神经功能缺损评分评估大鼠神经功能缺损程度。
UCMSCs移植组大鼠损伤区周围脑组织中CD90、CD73和CD105全阳细胞数比例较模型组明显增多（0.4%比0.1%，P<0.05）；HE染色结果显示UCMSCs移植组大鼠脑损伤情况较模型组有所减轻；UCMSCs移植组大鼠损伤区周围脑组织中VEGF表达高于模型组（P<0.05），GFAP和BDNF阳性细胞数均高于模型组（均P<0.05），且神经功能缺损评分亦高于模型组（P<0.05）。
UCMSCs移植治疗TBI大鼠可有效改善损伤区域的血管重建并促进神经恢复。
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颅脑创伤（traumatic brain injury，TBI）因其死亡率高已成为一项严重的公共卫生问题并越来越受到社会各界的广泛关注。TBI的高发病率和致残率给社会带来了巨大的经济负担，如能找到一套行之有效的治疗措施，将大大造福于TBI患者和社会。间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）是一类具有显著的自我更新和多向分化的细胞，其来源丰富，主要存在于骨髓、脐血、脐带、全身结缔组织和器官间质[1,2,3]。脐带作为MSCs的一种来源有着无法比拟的优势[4,5,6]。脐带间充质干细胞（umbilical cord mesenchymal stem cells, UCMSCs）与骨髓MSCs相比具有取材易，来源广，易收集、保存、冷冻，相对纯净，与干细胞输注相关的病毒和病原微生物感染率较低等优势[4,7,8]。近年来，随着干细胞技术的不断发展，其在很多领域已取得了令人鼓舞的效果。本研究旨在探讨UCMSCs移植治疗TBI大鼠的情况，为干细胞移植治疗TBI提供一定的理论基础和依据。
兔抗大鼠胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）多克隆抗体、兔抗大鼠脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor, BDNF）多克隆抗体（美国Santa Cruz公司），DMEM培养基、兔抗大鼠血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）多克隆抗体、生物素化二抗（IgG）、二氨基联苯胺显色试剂盒（美国Sigma-Aldrich公司），异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate, FITC）标记的CD73、别藻蓝蛋白（allophycocyanin, APC）标记的CD105、多甲藻黄素-叶绿素-蛋白质复合物（peridinin-chlorophyll-protein complex, PerCP）-CyTM标记的CD90多克隆抗体（美国BD公司），UltraCULYURETM无血清培养基（美国Lonza公司）。脐带来源于武警后勤学院附属医院，脐带的采集经产妇同意并签署知情同意书。无特定病原体级雄性Sprague-Dawley大鼠30只，体质量为（360±10）g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物合格证号为SCXK（京）2012-0001。
超净工作台(中国苏净集团安泰公司)，Eclipse E400荧光显微镜（日本Nikon公司），Olympus CX6光学显微镜（日本Olympus公司），Sigma 3-18K台式高速冷冻离心机（德国Sigma公司），68001单臂脑立体定向仪（深圳沃德生命科技有限公司），Image-Pro Plus多功能真彩色细胞图像分析管理系统（美国Media Cybernetics公司），RM2235组织切片机、RM2015石蜡切片机（德国Leica公司）。
脐带去表皮及血管取华通氏胶，再将华通氏胶剪碎、离心，放于CO2孵箱内培养；待较多细胞爬出时，进行传代培养，细胞活力≥95%且病原菌排查阴性，培养至第2~3代时用于本研究。
用质量浓度为30 g/L的戊巴比妥钠溶液按1 ml/kg腹腔注射麻醉大鼠，将大鼠顶部剃毛，常规消毒。TBI模型的制作采用Feeney's自由落体模型：剪开大鼠颅顶部皮肤，剥离肌肉和骨膜暴露冠状缝和人字缝，选用50 g砝码自90 cm高度使砝码自由落体撞击大鼠冠状缝和人字缝的交界处，造成闭合性TBI。然后将大鼠分笼饲养，意识障碍恢复后自行进水。经苏木精-伊红（hematoxylin-eosin staining, HE）染色观察脑组织病理学改变确认符合闭合性TBI的病理表现即表示TBI模型制作成功。该法构建的创伤模型更接近生活中所见的创伤类型，具有简便、易于复制和损伤程度较一致等优点。
实验大鼠于动物室内分笼喂养，室内温度为（20±3）℃，湿度为（50±20）%，每日光照12 h，并提供全营养鼠粮及足量清洁饮水。将实验大鼠按随机数字表法分为3组：正常对照组、模型组和UCMSCs移植组，每组10只。正常对照组不予任何处理；其余2组大鼠按1.2.2节方法构建TBI模型后被固定于立体定向仪上，脑室坐标以前囟点为0，右侧旁开1.5 mm，后旁开1.1 mm，深4.5 mm，模型组经脑室途径注射25 μl生理盐水，UCMSCs移植组则注射等体积的UCMSCs悬液（细胞总数为1.5 × 106），注射应缓慢以避免颅内压波动，5 min注射完毕，缓慢退针。
UCMSCs移植后第10天取各组大鼠损伤区周围同一部位脑组织0.5 g，在300目筛网上研磨，制成浓度为5×106/ml的单细胞悬液；分别取100 μl悬液加入流式管中，用FITC标记的CD73、APC标记的CD105、PerCP-CyTM标记的CD90多克隆抗体进行染色，各加入0.5 μl抗体溶液和3.5 μl含体积分数为2%胎牛血清的PBS避光孵育30 min，离心；加PBS洗涤，再离心，弃上清后加入200 μl PBS重悬，流式细胞仪检测特异性抗原表达情况。
UCMSCs移植后第10天取各组大鼠损伤区周围脑组织，用质量浓度为40 g/L的多聚甲醛溶液固定24 h，流水冲洗24 h，置于体积分数为70%~80%的乙醇中，可长期保存。将固定后的脑组织进行脱水和包埋：95%乙醇（2道）Ⅰ 2~4 h，Ⅱ 2 h；无水乙醇（2道）Ⅰ 1.5 h，Ⅱ 1 h；二甲苯+无水乙醇（体积比为1∶1）20 min；二甲苯（2道）Ⅰ 10 min，Ⅱ 10 min；浸软蜡（50~52 ℃）（2道）Ⅰ 30 min，Ⅱ 1 h；浸硬蜡（58~60 ℃）（2道）Ⅰ 30 min，Ⅱ 30 min；包埋。切片后进行染色：二甲苯脱蜡5道，每道5~10 min；无水乙醇Ⅰ 5 min，Ⅱ 5 min；95%乙醇Ⅰ 5 min，Ⅱ 5 min；80%乙醇5 min；70%乙醇5 min；Harris苏木素液5 min，水洗；体积分数为0.5%的盐酸乙醇分化10 s；水洗蓝化15~30 min（注意换水）；70%乙醇5 min；80%乙醇5 min；伊红液（95%乙醇溶液）3~30 s；95%乙醇Ⅰ 1 min，Ⅱ 5 min；无水乙醇Ⅰ 5 min，Ⅱ 5 min；二甲苯+乙醇（体积比为1:1）5 min；二甲苯Ⅰ 5 min，Ⅱ 5 min，Ⅲ 5 min；中性树胶封片，于光学显微镜下观察。
UCMSCs移植后第10天取各组大鼠损伤区周围脑组织，PBS冲洗，用质量浓度为40 g/L的多聚甲醛溶液固定24 h，包埋组织块，切片厚度5 μm，脱蜡，入水。将切片浸于二甲苯中2次，每次5 min；无水、95%、90%、85%、75%乙醇中各2次，每次5 min；自来水冲洗，PBS洗2次；体积分数为1%的甲醇双氧水室温浸泡10 min，蒸馏水洗1次以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS洗3次，每次5 min；将切片放入0.01 mol/L柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）中，于微波炉内微波辐射10 min；待修复液降至室温后，PBS洗3次，每次5 min；在切片上滴加正常山羊血清封闭液，室温20 min；滴加一抗（兔抗大鼠VEGF、GFAP、BDNF多克隆抗体）4 ℃过夜，PBS洗3次，每次5 min；滴加生物素化二抗（IgG），37 ℃ 20 min，PBS洗3次，每次5 min；滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37 ℃ 20 min，PBS洗3次，每次5 min；用二氨基联苯胺显色试剂盒显色，显色6 min后，充分水洗；苏木精复染细胞核1 min，充分水洗；体积分数为1%的盐酸乙醇分化，体积分数为1%的氨水反蓝，充分水洗，依次浸于70%、80%、90%、95%、无水乙醇中各2次，每次5 min进行脱水，二甲苯透明2次，每次5 min，中性树脂封片。最后，选择各组阳性和阴性组织相进行显微照相（×100）。
UCMSCs移植后第10天对各组大鼠进行神经功能缺损评分。0分：无神经损伤症状；1分：不能完全伸展对侧前爪；2分：向瘫痪侧转圈；3分：向对侧倾倒；4分：不能自发行走；意识丧失；5分：死亡。
采用SPSS11.0统计学软件处理数据，数据以均值±标准差（
±s）表示，组间比较采用t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。
由图1可知，UCMSCs移植组大鼠损伤区周围脑组织中CD90、CD73和CD105全阳细胞数比例较模型组明显增多（0.4%比0.1%），其差异具有统计学意义（P<0.05）。
HE染色结果显示，UCMSCs移植后第10天，UCMSCs移植组大鼠损伤区周围脑组织各层结构形态正常，各级神经元存在，间质局部水肿，皮质下、间质及脑室内脉络丛血管扩张充血（图2A）；模型组大鼠损伤区周围脑组织各级神经元存在，皮层下血管扩张充血，部分间质血管充血、出血，伴水肿变性，仍可见局部炎性细胞浸润（图2B）。由此可见，UCMSCs移植组脑组织损伤情况较模型组有所减轻，模型组炎性细胞浸润较UCMSCs移植组明显增多。
如图3所示，与模型组比较，UCMSCs移植组大鼠损伤区周围脑组织中VEGF的表达明显升高，且UCMSCs移植组第15天VEGF的表达高于第10天，差异均具有统计学意义（P<0.05）。
UCMSCs移植后第10天各组神经功能缺损评分情况如表1所示，与正常对照组比较，模型组及UCMSCs移植组神经功能缺损评分均明显降低，差异均具有统计学意义（均P<0.05）；与模型组比较，UCMSCs移植组神经功能缺损评分明显提高，差异亦具有统计学意义（P<0.05）。
各组神经功能缺损评分情况（
±s）
各组神经功能缺损评分情况（±s）
| 组别 | n | 神经功能缺损评分 |
|---|---|---|
| 正常对照组 | 10 | 4.90±0.11 |
| 模型组 | 10 | 1.91±0.14a |
| UCMSCs组 | 10 | 3.46±0.22ab |
注：UCMSCs—脐带间充质干细胞。与正常对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05
各组大鼠损伤区周围脑组织中BDNF和GFAP的表达情况如图4所示，与模型组比较，UCMSCs移植组每个视野内的BDNF和GFAP阳性细胞数均增多，差异均有统计学意义（均P<0.05）。
UCMSCs—脐带间充质干细胞；BDNF—脑源性神经营养因子；GFAP—胶质纤维酸性蛋白
TBI占全身创伤发生率的第二位，但致死率和致残率却位居第一，成为儿童和中青年人群最主要的死亡原因。美国每年发生TBI的人数占总人口的2%，TBI已成为青年人伤残和死亡的首要原因。中国每年发生TBI的人数约60万，其中死亡人数约10万。随着中国国民经济和道路交通等快速发展，中国TBI的发生率也逐年上升，已成为严重的公共卫生问题。TBI既耗费巨额的医疗费用，又造成大量的间接经济损失，严重影响了经济发展。
MSCs是一类来源于中胚层或神经外胚层的成体干细胞，广泛存在于多种成体器官和结缔组织中，如骨髓、脂肪、羊水、骨骼肌、胎肺、胎肝、脐血和脐带[3,4,5]。体外培养的MSCs形态似纤维母细胞，呈贴壁生长。在特定的诱导条件下，MSCs即可分化为中胚层来源的成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等，又可诱导分化为肝脏细胞、心肌细胞和神经细胞。体外培养的MSCs可分泌多种细胞因子，如肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子、纤维母细胞生长因子、低氧诱导因子、VEGF、血管生成素、单核细胞趋化蛋白和白细胞介素等，以起到维持机体稳态、抗炎及免疫调节的作用，使机体内环境稳定[6]。由于MSCs来源广泛且易于分离培养，又具有免疫豁免特性及免疫抑制能力，为其异体移植提供了可能[7]，现已迅速成为干细胞研究领域的热点，被广泛用于干细胞治疗的基础研究。
有文献报道，给予人源性MSCs治疗TBI和脊髓损伤较未给予MSCs治疗组预后明显改善，并可有效提高存活率[8,9,10,11]。笔者在TBI大鼠模型基础上给予UCMSCs治疗后发现，UCMSCs移植组大鼠脑组织受损程度较模型组有所减轻，损伤区周围脑组织中VEGF表达较模型组高（P<0.05）；BDNF和GFAP免疫荧光双染结果提示，UCMSCs移植组大鼠损伤区周围脑组织中BDNF及GFAP阳性细胞数均高于模型组（均P<0.05）。BDNF是一种具有神经营养作用的蛋白，其对创伤脑组织的恢复有着重要意义；而GFAP是成熟星形胶质细胞特有的中间丝成分，对神经生理功能和各种病理过程具有重要作用，尤其是病理状态下的GFAP高表达对细胞耐受水肿及炎症反应具有积极意义。由此笔者推测，给予UCMSCs移植后可有效改善受损组织周围的血液供应并改善局部微环境，对受损组织的恢复起到有益作用。
血管新生有血管生成和血管形成两种方式：血管生成是指通过血管内皮细胞迁移和增殖而在原有血管上以出芽的方式生长出新血管；血管形成是指在原先没有血管系统的情况下，通过内皮祖细胞和造血干细胞的分化和相互作用产生新血管[11,12,13]。笔者观察到经UCMSCs治疗后，TBI大鼠损伤区周围脑组织中VEGF表达上调，这对血供重建具有重要作用；另外UCMSCs可通过分泌某些营养因子及免疫调节蛋白等有效稳定机体内环境。
本研究在TBI大鼠模型上证实了行UCMSCs移植对创伤区域的恢复尤其是微循环的重建具有重要意义，并可有效改善神经损伤情况，为有针对性地靶向治疗提供了重要依据。
利益冲突 无
