探讨激动型CD40单克隆抗体在体外对结肠癌细胞增殖的抑制作用。
树突状细胞（DCs）经结肠癌冻融抗原致敏后予以不同条件激活，分为激动型CD40单克隆抗体组、阴性对照组及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）阳性对照组，诱导培养至第7天，用流式细胞仪检测各组DCs表面分化相关抗原CD80、CD83、CD86和HLA-DR的表达，酶联免疫吸附测定法检测DCs培养液上清中白细胞介素-12（IL-12）的质量浓度，噻唑蓝比色法检测DCs体外刺激T淋巴细胞增殖的能力，进而检测DCs所诱导的肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）对人结肠癌细胞HCT116的杀伤作用。
与阴性对照组相比，激动型CD40单克隆抗体组活化的DCs表面抗原CD80、CD83、CD86和HLA-DR的表达率均显著升高（均P<0.05），DCs上清中IL-12的质量浓度亦显著升高（（716.80±53.43）pg/ml比（405.51±12.17）pg/ml，P<0.05），活化的DCs具有更强的刺激T淋巴细胞增殖的能力（刺激指数2.006 2±0.438 3比1.365 0±0.209 8，P<0.05），活化的DCs所诱导的CTL对HCT116细胞具有更强的杀伤作用（抑制率（66.08±0.41）%比（46.60±1.10）%，P<0.05）；而与TNF-α阳性对照组相比，其差异均无统计学意义（均P>0.05）。
激动型CD40单克隆抗体在体外可促进DCs的活化与成熟，进而诱导肿瘤特异性CTL的产生，从而抑制人结肠癌细胞HCT116的增殖。
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CD40及其配体（CD40 ligand，CD40L）是体内免疫反应中的一对重要共刺激分子，文献报道，肿瘤微环境中的肿瘤细胞可分泌一些负性细胞因子下调CD40L的表达，抑制树突状细胞（dendritic cells，DCs）的活化，进而诱导T淋巴细胞免疫无能[1]。激动型CD40单克隆抗体可以外源激活DCs的第二信号系统，促进DCs的活化与成熟，使其分泌更多的白细胞介素-12（interleukin-12，IL-12）并诱导肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）的产生。因此，笔者通过观察激动型CD40单克隆抗体体外对负载人结肠癌细胞HCT116抗原的DCs的激活情况，进而诱导肿瘤特异性CTL的产生，并研究其体外对HCT116细胞增殖的抑制作用，为激动型CD40单克隆抗体在结肠癌免疫治疗中的应用提供依据。
人结肠癌细胞株HCT116（天津医科大学总医院普通外科研究所冻存），RPMI-1640培养基（美国HyClone公司），人外周血淋巴细胞分离液（北京索莱宝科技有限公司），小鼠抗人CD40单克隆抗体（美国R&D Systems公司），粒细胞与巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF）、重组人白细胞介素-2（recombinant human interleukin-2，rhIL-2）、rhIL-4、重组人抗肿瘤坏死因子-α（recombinant human tumor necrosis factor-α, rhTNF-α）（美国PeproTech公司），别藻蓝蛋白（allophycocyanin, APC）标记的小鼠抗人CD80单克隆抗体、异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate, FITC）标记的小鼠抗人CD83单克隆抗体、藻红蛋白（phycoerythrin, PE）标记的小鼠抗人CD86单克隆抗体、多甲藻黄素-叶绿素-蛋白质复合物（peridinin-chlorophyll-protein, complex, PerCP）标记的小鼠抗人HLA-DR单克隆抗体、PE标记的小鼠抗人CD3单克隆抗体及其同型对照抗体（美国BioLegend公司），hIL-12（p70）酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）试剂盒（96T）（武汉博士德生物工程有限公司），噻唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium, MTT）（美国Amresco公司）。
SE光学显微镜（日本Nikon公司），Thermo CR3i冷冻型多功能离心机、NAPCO6500二氧化碳细胞培养箱（美国Thermo Electron公司），ND-1000全波长紫外/可见光扫描分光光度计（美国NanoDrop公司），BD FACSCantoⅡ流式细胞仪（美国BD公司），Tecan Safire 2多功能酶标仪（瑞士Tecan公司）。
复苏冻存的人结肠癌细胞HCT116，进行传代培养。取生长状态良好的肿瘤细胞，反复冻融4次，160×g离心10 min，取上清，上清即为结肠癌冻融抗原溶液。将上清过滤除菌后用全波长紫外/可见光扫描分光光度计测定蛋白含量，其余分装后于-20 ℃保存备用。
取20 ml健康志愿者外周血（经乙二胺四乙酸抗凝处理），加入人外周血淋巴细胞分离液，利用密度梯度离心法获取外周血单个核细胞，调整细胞悬液浓度至（1~5）×106/ml，培养过夜；将未贴壁的悬浮细胞离心、洗涤，收集备用；贴壁细胞则主要为DCs前体细胞。
利用培养基选择法[2]获取DCs，向DCs前体细胞各孔中加入RPMI-1640完全培养基（含100 U/ml青霉素、质量浓度为100 μg/ml的链霉素和体积分数为10%的胎牛血清），并同时加入GM-CSF（1 000 U/ml）和rhIL-4（500 U/ml），充分混匀后，于细胞培养箱中开始诱导培养；诱导培养至第4天时，每孔分别加入先前制备的结肠癌冻融抗原，使其终质量浓度为25 μg/ml，混匀后置于细胞培养箱内培养过夜，使DCs负载结肠癌抗原；诱导培养至第5天时，予以不同条件激活DCs，激动型CD40单克隆抗体组加入人激动型CD40单克隆抗体（2 μg/ml），TNF-α阳性对照组加入rhTNF-α（50 ng/ml），阴性对照组加入等体积的无菌磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline, PBS）；诱导培养至第7天时，于光学显微镜下观察各组细胞形态及生长状态，收集各组DCs悬液，160×g离心10 min，分别收集各组细胞培养液上清及DCs沉淀；将各组DCs沉淀重悬后加入流式细胞管中，每管100 μl，分别加入APC标记的小鼠抗人CD80单克隆抗体、FITC标记的小鼠抗人CD83单克隆抗体、PE标记的小鼠抗人CD86单克隆抗体、PerCP标记的小鼠抗人HLA-DR单克隆抗体及各同型对照抗体5 μl，室温避光孵育30 min，PBS洗2次；160×g离心5 min，弃上清，加入质量浓度为40 g/L的多聚甲醛溶液重悬固定，充分吹打均匀后用流式细胞仪检测各组DCs表面抗原CD80、CD83、CD86和HLA-DR的表达。
取1.2.2节中诱导培养至第7天时收集的各组DCs培养液上清，操作步骤严格按hIL-12（p70）ELISA试剂盒说明书进行，显色后即用多功能酶标仪测定各组DCs培养液上清在450 nm处的吸光度（A）值，根据标准曲线计算IL-12的质量浓度。
收集1.2.2节DCs贴壁培养过程中的未贴壁细胞，调整其浓度至5×106/ml，加入流式细胞管中，每管100 μl，分别加入5 μl PE标记的小鼠抗人CD3单克隆抗体及其同型对照抗体，室温避光孵育30 min，PBS洗2次；160×g离心5 min，弃上清，加入质量浓度为40 g/L的多聚甲醛溶液重悬固定，吹打均匀后用流式细胞仪进行检测。
分别调整各组激活的DCs及分离获取的T淋巴细胞浓度至（1~5）×105/ml，将不同条件激活的DCs与T淋巴细胞按细胞数比1∶10分别接种于96孔板中，每组设3~5个复孔，终体积为200 μl，另设T淋巴细胞单独培养孔作为对照组；每孔加入rhIL-2（500 U/ml），每半天更换RPMI-1640完全培养基；培养至第7天时，每孔加入20 μl质量浓度为5 g/L的MTT溶液，孵育4 h后，70×g离心10 min，弃上清；加入150 μl二甲基亚砜，充分振荡后用多功能酶标仪测定各孔于570 nm处的A值。按下式计算各组T淋巴细胞的增殖刺激指数（stimulation index，SI）
刺激指数=实验组A值/对照组A值×100%
将上述各组DCs所诱导的效应T淋巴细胞（用RPMI-1640培养基调整浓度至（1~5）×106/ml）作为效应细胞，与作为靶细胞的HCT116细胞（用RPMI-1640培养基调整浓度至（1~5）×105/ml）按效靶比10∶1混合培养，另设单纯靶细胞孔及各组单纯效应细胞孔，每组设3~5个复孔，终体积为200 μl；培养至第3天时，每孔分别加20 μl质量浓度为5 g/L的MTT溶液，孵育4 h后，加入150 μl二甲基亚砜，充分振荡后用多功能酶标仪测定各孔于570 nm处的A值。按以下公式计算抑制率（%）
式中：At为单纯靶细胞孔吸光度值，Ae为实验组吸光度值，Ar为单纯效应细胞孔吸光度值。
采用SPSS17.0统计学软件处理数据，数据均以均值±标准差（
±s）表示，两组间均值比较采用t检验，多组间均值比较采用One-way ANOVA方差分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。
经反复冻融法获得可溶性结肠癌冻融抗原溶液，过滤除菌后，用全波长紫外/可见光扫描分光光度计测得结肠癌冻融抗原的质量浓度为（2.01±0.22）mg/ml。
DCs前体细胞在细胞因子GM-CSF和rhIL-4联合诱导作用下培养，第1天时于镜下观察可见各组细胞均贴壁生长，体积较小，形态规则，多为圆球形，很少有突起。第7天时，激活型CD40单克隆抗体组和TNF-α阳性对照组诱导活化的DCs大部分分散开，呈悬浮状态生长，体积较大，形状不规则，呈星形、梭形等，同时可见有突起呈树枝状、毛刺状向四周伸展，且突起数量不等、粗细各异，多数细胞具有典型的DCs形态；而阴性对照组的DCs形态相对规则，单个视野内具有典型形态的细胞数量偏少。（图1）
经GM-CSF和rhIL-4体外联合诱导培养至第7天，用流式细胞仪检测各组DCs的表型，结果显示，激动型CD40单克隆抗体组DCs表面标志物CD80、CD83、CD86和HLA-DR的表达率分别为（92.5±6.7）%、（22.4±5.3）%、（81.3±7.5）%和（87.8±3.7）%，均显著高于阴性对照组（（74.2±6.6）%、（12.2±4.2）%、（61.4±8.0）%和（70.7±7.7）%），差异均有统计学意义（均P<0.05）；而与TNF-α阳性对照组（（93.5±6.3）%、（23.8±5.0）%、（81.7±9.1）%和（90.0±3.6）%）相比，差异均无统计学意义（均P>0.05）。（图2、图3）
SSC—侧向角散射；APC—别藻蓝蛋白；FITC—异硫氰酸荧光素；PE—藻红蛋白；PerCP—多甲藻黄素-叶绿素-蛋白质复合物
与阴性对照组比较，aP<0.05
DCs体外诱导培养至第7天，用ELISA法检测各组DCs培养液上清中IL-12的质量浓度，结果显示，经激动型CD40单克隆抗体处理后的DCs培养液上清中IL-12的质量浓度为（716.80±53.43）pg/ml，明显高于阴性对照组（405.51±12.17）pg/ml，差异具有统计学意义（P<0.05）；而与TNF-α阳性对照组（715.21±55.72）pg/ml相比，差异无统计学意义（P>0.05）。（图4）
1—阴性对照组；2—肿瘤坏死因子⁃α阳性对照组；3—激动型CD40单克隆抗体组。与阴性对照组比较，aP<0.05
将体外培养所获得的各组DCs与T淋巴细胞混合培养，用MTT比色法检测T淋巴细胞的增殖能力，结果表明，经CD40单克隆抗体处理后的DCs诱导T淋巴细胞增殖的SI为2.006 2±0.438 3，显著高于阴性对照组（1.365 0±0.209 8），差异具有统计学意义（P<0.05）；而与TNF-α阳性对照组（1.977 8±0.370 4）相比，差异无统计学意义（P>0.05）。（图5）
1—阴性对照组；2—肿瘤坏死因子⁃α阳性对照组；3—激动型CD40单克隆抗体组。与阴性对照组比较，aP<0.05
经CD40单克隆抗体处理后的DCs所诱导产生的肿瘤特异性CTL对HCT116细胞的增殖抑制率为（66.08±0.41）%，明显高于阴性对照组（46.60±1.10）%，差异具有统计学意义（P<0.05）；而与TNF-α阳性对照组（66.21±1.73）%相比，差异无统计学意义（P>0.05）。（图6）
1—阴性对照组；2—肿瘤坏死因子⁃α阳性对照组；3—激动型CD40单克隆抗体组。与阴性对照组比较，aP<0.05
结肠癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，中国2015年新发结肠癌病例37.6万，死亡人数达19.1万，其发病率和死亡率居恶性肿瘤前列[3]。传统的治疗结肠癌的方法包括手术治疗、放射治疗（放疗）和化学药物治疗（化疗），然而对于多数结肠癌患者，手术治疗并不能根治性切除病灶，且患者对放、化疗并不敏感。近年来，肿瘤免疫治疗作为继手术治疗、放疗和化疗之后的一种肿瘤治疗手段，在结肠癌的治疗中越来越受到重视，而诱导肿瘤特异性T淋巴细胞的产生是目前肿瘤免疫治疗研究的核心内容之一[4]。T淋巴细胞的激活需要两类信号系统：一类是通过抗原提呈细胞加工主要组织相容性复合体-I类分子抗原来实现，另一类则依赖于非主要组织相容性复合体限制的共刺激信号。在肿瘤免疫中，CD40-CD40L是体内主要的共刺激信号，DCs提呈肿瘤抗原通过CD40-CD40L信号通路诱导肿瘤特异性CTL的产生，进而对肿瘤产生杀伤作用[5]。然而有研究结果显示，在肿瘤微环境中，肿瘤细胞及其基质细胞可通过产生一些负性细胞因子，如IL-13、IL-10、转化生长因子-β等，抑制DCs的第二信号系统，从而抑制DCs的活化与成熟，致使DCs诱导效应性T淋巴细胞无能和诱导抑制性调节T淋巴细胞（Treg细胞）产生，进而诱导机体产生免疫耐受或免疫无能[1,6,7,8]。
有文献报道，激动型CD40单克隆抗体可与DCs表面的CD40结合，促进DCs的活化与成熟，在缺少CD4+辅助性T淋巴细胞的作用下，直接激活CD8+ T淋巴细胞，诱导肿瘤特异性CTL的产生[9,10]。目前，尚无鉴定DCs的特异性生物学分子标志，故笔者通过镜下观察DCs的形态特征、检测细胞表面分子CD80、CD83、CD86和HLA-DR的表达情况以及混合淋巴细胞反应观察DCs刺激T淋巴细胞的分化增殖能力来综合分析DCs是否活化与成熟。在本研究中，笔者以TNF-α作为阳性对照组，TNF-α是目前实验室中应用最多的活化并促进DCs成熟的细胞因子[11]。笔者在研究中发现，体外成功培养的负载肿瘤抗原的DCs经激动型CD40单克隆抗体处理后，可于镜下观察到大多数细胞具有典型的成熟DCs形态；流式细胞仪检测到DCs表面高表达CD80、CD83、CD86和HLA-DR。同时，笔者检测了DCs培养液上清中IL-12的质量浓度，发现经CD40单克隆抗体处理后的DCs培养液上清中的IL-12质量浓度较阴性对照组显著升高（P<0.05），表明外源加入激动型CD40单克隆抗体可促进DCs的活化与成熟，使其分泌更多的IL-12。笔者进而将活化的DCs体外进行混合淋巴细胞培养，发现加入激动型CD40单克隆抗体所活化的DCs可促进肿瘤特异性T淋巴细胞的活化和增殖，较阴性对照组明显产生了更多的肿瘤特异性CTL，差异具有统计学意义（P<0.05）。这些进一步证明激动型CD40单克隆抗体体外可与DCs上的CD40结合，激活DCs的第二信号系统，诱导产生更多的肿瘤特异性CTL。因此，笔者从细胞形态、分子表型及免疫功能3方面综合分析认为激动型CD40单克隆抗体可更好地活化负载肿瘤抗原的DCs，促进其进一步成熟，并增强其免疫学功能。此外，笔者进一步检测活化的肿瘤特异性CTL在体外对肿瘤的杀伤作用，发现加入激动型CD40单克隆抗体活化的DCs所诱导产生的肿瘤特异性CTL较阴性对照组在体外对HCT116细胞具有更强的杀伤作用（P<0.05）。
综上所述，激动型CD40单克隆抗体在体外可活化负载结肠癌抗原的DCs并促进其成熟，活化的DCs不仅能促进更多肿瘤特异性CTL的产生，且产生的CTL对肿瘤的杀伤作用更强。
利益冲突 无
