制备光敏剂5-氨基酮戊酸(ALA)和血卟啉单甲醚(HMME)水凝胶栓剂,评价其对直肠肿瘤组织的光敏剂递送效率。
将皮下移植人直肠癌细胞SW837的BALB/c小鼠随机分为水凝胶栓剂直肠局部给药组、皮肤局部给药组、瘤内注射给药组和静脉注射给药组。用荧光光谱仪测量直肠壁、皮肤和皮下肿瘤中原卟啉(PpⅨ)和HMME的浓度,荧光光谱系统测定相应的光敏剂分布情况。
ALA水凝胶栓剂直肠局部给药组的PpⅨ浓度分别是皮肤局部给药组的9.76倍(1 h)和5.80倍(3 h),差异均具有统计学意义(均P<0.05)。皮肤局部给药后2 h,ALA在肿瘤组织内达到最大穿透深度(3~6 mm)。而HMME水凝胶栓剂直肠局部给药后,直肠壁中的HMME浓度极低,且皮肤局部给药后的最大肿瘤穿透深度不足2 mm。
与皮肤相比,ALA更易穿透黏膜屏障,以水凝胶栓剂形式直肠局部给药有望成为ALA用于光动力疗法治疗直肠癌的一种给药方式。
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光动力疗法(photodynamic therapy,PDT)[1,2,3]是在光、光敏剂和组织氧的相互作用下,通过直接氧化损伤、血管衰竭及抗肿瘤免疫系统的激活来选择性杀伤肿瘤组织[4,5,6]。早期由于光源的穿透深度有限,PDT基本仅用于浅表肿瘤的治疗。近年来,随着光纤、内窥镜等光递送系统的发展,使PDT治疗基底癌和实体肿瘤成为可能[7]。目前,PDT的研究主要集中在皮肤癌、膀胱癌和脑部肿瘤的治疗,同时也用于银屑病、黄斑变性、皮肤烧伤、溃疡等非肿瘤疾病的治疗[8,9,10,11,12]。
结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是人类主要恶性肿瘤之一。在全球流行病学研究中,CRC在常见的癌症中位列第三,其致死率位居第四[13]。在欧洲CRC的发病率每年以2.5%的速度递增。尽管医学研究在不断发展,但仍有1/3的患者出现CRC转移和治疗后复发[14],因此,CRC是现代医学面临的一个重大挑战。
随着新药的研制和治疗方案的改进,CRC的诊断和治疗效果已得到显著改善[15,16,17,18,19]。肿瘤化疗敏感性的降低和耐药性的增加及其对健康组织的非特异性毒副作用对CRC新疗法提出了迫切需求。高发病率、高侵袭性、高转移率及潜在的高复发率表明CRC的治疗必须采用根治疗法,在选择性破坏肿瘤细胞、不损伤正常组织、减少肠道壁穿孔风险的同时提高肿瘤特异性杀伤。PDT的肿瘤特异性、无耐药性和良好的美容效果[20]使其在CRC的治疗中显示出一定优势。然而,目前尚无PDT治疗CRC的精确临床方案,使得PDT的各种治疗参数,如光敏剂的类型、浓度和光剂量等均需在治疗前进行选择[21,22,23]。用于CRC治疗的光敏剂有卟啉、酞菁、5-氨基酮戊酸(5-aminolevulinic acid, ALA)等。它们均需通过静脉注射或口服方式给药。虽然有不少关于新光敏分子的研发和已有光敏药物的改进以提高光敏剂对CRC细胞靶向性的报道,但均未涉及对光敏剂给药方式的创新性研究。
通过栓剂方式给药在结直肠的摄取中具有滞留时间长、直肠黏膜吸收均匀及更易被患者接受的优点[24]。本研究中,笔者主要评估了直肠肿瘤对ALA和HMME水凝胶的摄取效率,并比较了直肠局部给药与常用的3种给药方式(皮肤局部给药、瘤内注射给药和静脉注射给药)的差异,旨在寻找更为有效的光敏剂给药途径,从而推进PDT治疗直肠癌的临床应用。
ALA(118 mg/瓶,粉末状,纯度99.8%,国药准字H20070027)、血卟啉单甲醚(hematoporphyrin monomethyl ether, HMME)(100 mg,纯度99.8%,国药准字H20120076)(上海复旦张江生物医药股份有限公司),胎牛血清、RPMI-1640培养基、青霉素-链霉素溶液(青霉素100 μg/ml,链霉素100 μg/ml)(美国Gibco公司),海藻酸钠、氯化钙(美国Sigma-Aldrich公司),人直肠癌细胞系SW837(中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所)。健康无特定病原体/无病毒抗体级4~6周龄BALB/c雄性小鼠60只,体质量15~20 g,购于北京华阜康生物科技股份有限公司,许可证号为SYXK(京)2016-0036。
QuantaMaster 40荧光光谱仪(美国PTI公司),USB4000分光计、USB-ISS-UV-VIS-2激光光源、Y型定制光纤(美国海洋光学公司),NFP-1461线性部分(北京卓立汉光仪器有限公司)。
将118 mg ALA粉末溶于500 μl海藻酸钠溶液(质量浓度为30 g/L)中制成质量分数为20%的ALA溶液;将HMME溶于磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline, PBS)中制成质量浓度为10 mg/ml的HMME储存液,于-20 ℃保存,再吸取HMME储存液50 μl,用海藻酸钠溶液稀释至500 μl,制成质量浓度为1 mg/ml的HMME溶液。分别取上述2种溶液50 μl,滴至5 μl质量浓度为50 g/L的CaCl2溶液中(体积比为10:1),1 min后即得ALA和HMME 2种水凝胶。
光敏剂水凝胶在PBS中的体外释放测定方法如下:取光敏剂水凝胶于1 ml PBS中,并于37 ℃水浴锅中轻晃;于预设时间点取100 μl溶液,并补充等体积的PBS。所得样品中的ALA浓度用典型的二甲氨基苯甲醛比色法[25]测定,HMME的浓度用荧光光谱仪检测。根据检测结果计算2种光敏剂水凝胶的累积溶出率。
光敏剂水凝胶在生理学条件下的体外释放测定方法如下:将水凝胶置于孵有SW837细胞的含体积分数为10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中,并于37 ℃水浴锅中轻晃。其余操作同上。
人直肠癌细胞系SW837于含体积分数为10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素溶液的RPMI-1640培养基中生长。BALB/c小鼠于动物室内分笼喂养,每笼5只,室内温度为(21±2)℃,相对湿度为30%~70%,明暗交替时间为12 h,平均日饲料消耗量为5 g(每100克体质量),平均日饮水消耗量为6~7 ml(每100克体质量)。于BALB/c小鼠右后臀部接种SW837细胞(2×106个),待肿瘤尺寸约为10 mm×10 mm时进行治疗。
将皮下移植SW837细胞的BALB/c小鼠随机分为直肠局部给药组、皮肤局部给药组、瘤内注射给药组和静脉注射给药组,每组15只。直肠局部给药组:将50 μl质量分数为20%的ALA溶液或质量浓度为1 mg/ml的HMME溶液经小鼠肛门注射入直肠腔道,小鼠由尾巴提起倒立以防渗漏;再迅速注入5 μl 0.1 mol/L的CaCl2溶液,将小鼠身体放平,以便形成栓剂。皮肤局部给药组:将50 μl质量分数为20%的ALA溶液或质量浓度为1 mg/ml的HMME溶液滴加于小鼠荷瘤皮肤表面,再加入5 μl 0.1 mol/L的CaCl2溶液形成水凝胶,并用塑料袋包裹该区域,以防蒸发,动物可于黑暗环境下在笼中自由移动。瘤内注射给药组:将50 μl质量浓度为1 mg/ml的HMME溶液用PBS稀释后缓慢注射入肿瘤中部,并迅速撤回针头。静脉注射给药组:由小鼠尾静脉注射50 μl质量浓度为1 mg/ml的HMME溶液。
在指定时间点处死动物,于10 min内迅速取出整个肿瘤组织,沿纵向切成两半。一半用于测定光敏剂分布,另一半被分为皮下肿瘤和皮肤2部分以测定光敏剂的浓度。于齿状线以上切取直肠壁全层段(长约1 cm)。
组织中ALA和HMME的浓度采用陈文晖等[25]报道的改良方法进行测定。用小鼠血浆制备了质量浓度范围为0.010~1.560 μg/ml的标准曲线。即将100 μl含1.7 μg原卟啉(protoporphyrin Ⅸ,PpⅨ)或HMME的血浆与1.6 ml含1 mol/L HCl的质量浓度为90 g/L的NaCl溶液混合,室温静置10 min后1 000×g离心10 min,收集上清(含1 μg/ml光敏剂),用质量浓度为50 g/L的NaOH溶液倍比稀释至终质量浓度为0.015 μg/ml。用荧光光谱仪检测样品的荧光强度。HMME的激发波长和发射波长分别是395 nm和627 nm,PpⅨ分别为395 nm和638 nm。以x轴为光敏剂的质量浓度,y轴为荧光强度建立标准曲线,回归得线性方程。
对切取的皮肤、皮下肿瘤和直肠壁样品称其质量,机械研磨后用细胞裂解液裂解以释放出光敏剂。1 000 ×g离心10 min后取上清,用荧光光谱仪检测其荧光强度,再通过标准曲线计算对应的光敏剂浓度(光敏剂浓度以μg/g组织表示)。
取一半肿瘤组织于样品架上,暴露垂直剖面以方便检测。笔者搭建的荧光光谱系统如图1所示,由分光计、激光光源、Y型定制光纤和线性部分组成。光纤沿肿瘤组织的垂直剖面线由皮肤到肿瘤进行扫描,每隔1~2毫米测量其荧光信号。
采用SPSS13.0统计学软件处理数据,数据以均值±标准差(±s)表示,组间比较采用单因素方差分析,以P<0.05为差异具有统计学意义。
ALA和HMME水凝胶如图2插入部分所示。ALA水凝胶在PBS中全部释放出ALA仅需10 min;在孵有SW837细胞的RPMI-1640培养基中需30 min,且累积溶出率从60 min开始下降,表明释放出的ALA很快被细胞吸收。相比之下,HMME水凝胶在PBS和培养基中的释放速率均低于ALA水凝胶,但其在15 min时也开始释放。在PBS中,2 h时累积溶出率下降,8 h后仅有50%的HMME从水凝胶中释放出来;在RPMI-1640培养基中,HMME的累积溶出率保持在36.8%,表明在HMME的释放和细胞摄取之间存在动态平衡。(图2)
图中的插入部分为制作的光敏剂水凝胶的形貌
将HMME和PpⅨ分别溶于小鼠血浆中以建立标准曲线,其中PpⅨ为细胞内ALA的荧光代谢产物。2者的标准曲线在0.010~1.000 μg/ml内具有良好的线性关系,其回归系数分别为0.999 5和0.986 4。
HMME的线性方程为
PpⅨ(ALA)的线性方程为
式中:x为光敏剂的质量浓度,y为对应的荧光强度。通过线性方程即可计算出实验组织样本中的光敏剂含量。
笔者首先比较了直肠和皮肤局部给药后直肠壁和皮肤对ALA和HMME的吸收情况,即将ALA水凝胶和HMME水凝胶分别通过直肠和皮肤局部给药,并于给药后的不同时间点测量直肠壁和皮肤中的光敏剂浓度。结果显示,直肠壁对ALA的吸收远高于皮肤。给药后1 h和3 h时,直肠壁中的PpⅨ浓度分别是皮肤的9.76倍和5.80倍,差异均具有统计学意义(均P<0.05)(图3A)。3 h时,直肠壁对ALA的吸收达到最大,随后减小;而皮肤中的ALA浓度在给药后5 h时仍在增加。上述结果表明,以水凝胶栓剂形式给药时,与皮肤相比,ALA能迅速在直肠壁积聚并达到最大浓度。相反,只有极少量的HMME被直肠壁吸收,且随着时间延长,浓度持续稳定下降;而皮肤中的HMME浓度始终维持在相对较高水平(图3B)。其原因可能是由于真皮对高相对分子质量的HMME不易吸收,导致HMME有可能在皮肤中潴留,而通过直肠局部给药的HMME更倾向于被直肠黏膜分泌液清除。同时,笔者也检测了静脉注射给药后直肠壁和皮肤对HMME的吸收情况,结果发现,直肠壁中的HMME浓度高于皮肤,但24 h时皮肤中的HMME浓度急剧增加(图3C)。上述结果表明,与水凝胶栓剂局部给药相比,静脉注射给药后直肠壁对HMME的吸收效果更好。
与相同时间点的皮肤比较,aP<0.05
本研究的初始目的为检测直肠原位肿瘤对光敏剂的吸收程度,但因直肠原位肿瘤的建模面临一系列的技术挑战,故笔者通过评价皮肤、直肠壁和皮下肿瘤对光敏剂的吸收情况,在此基础上估算原位直肠肿瘤对光敏剂的吸收。ALA水凝胶经皮肤局部给药后,2 h内皮下肿瘤中的PpⅨ浓度增加,直到4 h时仍保持在相对较高水平(图4A)。HMME水凝胶经皮肤局部给药后,只有极少量被皮下肿瘤吸收,而皮肤中的HMME浓度较高(图4B),其原因可能是HMME对皮肤有黏附性。瘤内注射HMME后皮下肿瘤内呈现高浓度HMME;同时皮肤中也包含高浓度HMME,有可能是进针或出针过程中针头泄漏所致(图4C)。静脉注射HMME后,皮肤和皮下肿瘤中的HMME分别于24 h和6 h时达峰值(图4D),巨大时间差异表明可于静脉注射HMME 6 h后进行PDT治疗,此时肿瘤中的HMME浓度最大。
与相同时间点的皮肤比较,aP<0.05
将上述测定结果代入以下公式
式中:Te为原位直肠肿瘤中的光敏剂计算浓度,Rm为直肠壁中的光敏剂浓度,Tm为皮下肿瘤中的光敏剂浓度,Sm为皮肤中的光敏剂浓度。通过公式(3)计算得到原位直肠肿瘤中的PpⅨ浓度比皮下肿瘤高3~5倍,并具有时间依赖性(图5A)。该结果表明,以栓剂形式局部给药是一种有效的将ALA递送至直肠肿瘤的给药途径。HMME由于相对分子质量高而难以透过皮肤和黏膜屏障(图3B、图4B),按公式(3)计算也得到相同的结果(图5B)。
Tm—皮下肿瘤中的光敏剂浓度;Te—原位直肠肿瘤中的光敏剂计算浓度
光敏剂在目标肿瘤中的分布和浓度对PDT有重要影响。局部给药时,光敏剂的穿透深度直接影响着PDT的疗效;但由于PpⅨ的荧光信号微弱及其在深部组织中的穿透深度有限,故很难进行在体测量[26]。笔者检测了新鲜肿瘤组织垂直剖面的PpⅨ荧光强度。在ALA水凝胶皮肤局部给药后的不同时间点,切取肿瘤组织,将肿瘤组织均分为两部分,一部分置于样品架上,垂直剖面用分光计扫描,测量间隔为1 mm。ALA水凝胶皮肤局部给药后ALA的穿透深度为3~6 mm,且具有时间依赖性。给药后1 h,穿透深度为3 mm;给药后2 h,穿透深度达6 mm;给药后4 h,其所有深度(除2 mm处)的荧光强度均很弱,其原因可能是扫描路径中有血管存在,而血管中的血红蛋白会显著影响荧光信号。(图6)
皮肤深度设为0
如前所述,HMME水凝胶皮肤局部给药后,皮下肿瘤中只有极少量的HMME(图4B)。为进一步证实此结果,笔者检测了HMME在肿瘤组织中的分布。结果表明,HMME水凝胶皮肤局部给药后,只有在皮下深度达2 mm时,才能检测到实质性的荧光信号(图7A),这与笔者之前的研究结果相一致。同时,笔者还测量了静脉注射后HMME在皮下肿瘤中的分布。因前期实验中HMME静脉注射后,皮下肿瘤和皮肤对HMME的吸收达峰值的时间点分别为给药物后6 h和24 h(图4D),故笔者分别测量了给药后6 h和24 h时HMME在肿瘤组织中的分布。结果显示,这2个时间点HMME在肿瘤组织中的分布相一致,尽管6 h时HMME的荧光强度显著较高(图7B、图7C),但并未观察到皮肤中的HMME水平在24 h时有所增加(图4D),其原因可能是由于皮肤太薄,以致检测系统不能准确接收荧光信号。
皮肤深度设为0
目前已有多种方法来增强ALA或其化学衍生物的局部渗透,以提高高相对分子质量光敏剂的靶向输送,如卟啉、二氢酞菁和泰克萨菲瑞。相对于局部渗透,用于提高PDT治疗皮肤病及皮下肿瘤效果的方法包括瘤内注射、结节性病变刮除、皮肤磨削术、超声促渗、离子电渗疗法、光机械效应和微阵列分析[27,28,29,30];然而,这些方法极少被研究用于黏膜或黏膜下肿瘤的PDT治疗。同样,各种载体和靶向系统已被用于改善现有的光敏剂递送体系;但这些化合物缺乏对快速增殖细胞的选择性,且极易在体内降解,故迫切需要更可行的方法。新的光敏分子与光敏剂在其应用于临床前须经过临床前和临床评估后方可得到批准。本研究中,笔者测定了光敏剂在直肠肿瘤中的浓度和分布,以探讨使用ALA和HMME水凝胶栓剂进行PDT治疗直肠癌的可行性。
目前,卟啉前体物ALA及其甲酯是局部PDT最广泛使用的药物[27,28]。ALA介导的局部PDT对几种浅表基底细胞癌、光化性角化病、Bowen氏病、鳞状细胞癌、非恶性病变(如银屑病、病毒疣、乳头状瘤、蕈样肉芽肿)和其他病变具有显著疗效(显效率从50%到几乎100%)[8]。ALA是一种小分子物质(相对分子质量为167.6),局部给药后易扩散至皮肤组织;但亲水性限制了其跨越角质层的能力。由于黏膜上皮细胞无角质层,故ALA能相对容易地穿透黏膜组织。在本研究中,笔者发现局部给药后1 h和3 h时直肠壁中的PpⅨ浓度分别是皮肤的9.76倍和5.80倍,表明ALA以栓剂形式给药有望用于直肠癌和肛门癌的治疗。事实上,笔者基于皮下肿瘤模型估算了原位直肠肿瘤中的PpⅨ浓度是皮肤的3~5倍(图4)。图6显示,2 h时,ALA在皮下肿瘤的穿透深度为3~6 mm,且随着时间延长未进一步增加。虽然ALA穿透黏膜上皮细胞较皮肤更容易,笔者认为其穿透直肠肿瘤会类似于皮下肿瘤。因此,水凝胶栓剂不仅适用于递送ALA至直肠黏膜下肿瘤,还可通过增加ALA的局部浓度来提高PDT效应。HMME是国产的第2代光敏剂,临床前评估验证了其用于PDT治疗鲜红斑痣的有效性,目前正被研究用于广泛的诊断和治疗中[31]。与其他卟啉衍生物类似,HMME因相对分子质量高(>500)而对角质层存在低渗透性。目前,尚无关于HMME可穿透黏膜组织的报道。本研究中,以水凝胶栓剂给药后,在直肠壁中只能观察到低水平的HMME,且只有在皮下2 mm的深度才能检测到荧光信号。这些结果表明,水凝胶不适用于HMME的递送。而静脉注射给药后皮下肿瘤和皮肤中的HMME达到吸收峰值有明显的时间差异,故静脉注射给药是较好的HMME给药方式。
与皮肤相比,ALA更易穿透直肠黏膜屏障,以水凝胶栓剂形式局部给药有望成为ALA用于PDT治疗直肠癌的一种给药方式。但本研究结果还需用原位直肠癌模型进一步验证。本研究为直肠肿瘤的光敏剂递送提供了新思路。
利益冲突 无