建立获得大量P0代人胎盘绒毛膜间充质干细胞（hpcMSCs）培养方法。
从胎盘绒毛膜分离出hpcMSCs，经初次培养和再次培养7 d后，将原培养瓶中培养基、未贴壁组织和冲洗生理盐水离心后分别进行再次培养和第3次培养。用倒置显微镜观察细胞形态，CCK-8测定细胞生长曲线，流式细胞术检测细胞表面标记，成脂、成骨诱导分化试剂盒鉴定细胞的分化潜能。
获得的hpcMSCs均为成纤维细胞样贴壁细胞，每例胎盘获得（25.54±3.38）×106个P0代细胞，初次培养、再次培养和第3次培养获得的细胞数分别为（11.73±2.09）×106、（11.12±1.42）×106和（2.69±0.71）×106，培养时间分别为（12.00±0.64）d、（8.87±0.63）d和（12.33±0.80）d。再次培养时间和获得细胞数同初次培养、第3次培养差异均有统计学意义（均P<0.05），初次培养和第3次培养的时间差异无统计学意义（P>0.05），但第3次培养有时间延迟的趋势。3次培养的每培养瓶获得细胞数分别为（1.12±0.15）×106、（2.10±0.16）×106和（1.04±0.16）×106，再次培养获得细胞数同初次培养、第3次培养差异均有统计学意义（均P<0.05），初次培养和第3次培养获得细胞数差异无统计学意义（P>0.05），但第3次培养有细胞数量减少的趋势。3次培养的细胞生长曲线和表面标记的表达率无差异，成骨、成脂诱导分化检测均呈阳性。
一份绒毛膜标本，通过3次培养，获得的P0代hpcMSCs细胞数量比初次培养翻倍，本方法可为再生医学提供足够的种子细胞。
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间充质干细胞是普遍存在于不同组织的多潜能成体干细胞，是组织工程研究中一种重要的种子细胞和基因治疗载体。间充质干细胞的临床转化应用已成为研究热点[1,2,3,4]，其中如何获得大量原代间充质干细胞是各项研究的关键。本研究旨在优化人胎盘绒毛膜间充质干细胞（human placental chorionic-derived mesenchymal stem cell, hpcMSCs）的培养方法，以便大量获得原代（P0）间充质干细胞，以期为间充质干细胞的应用研究提供基础。
经广州医科大学附属广州市妇女儿童医疗中心伦理委员会批准并征得产妇和家属书面知情同意的情况下，在广州市妇女儿童医疗中心产科取剖宫产健康足月的新生儿胎盘（n=30），胎盘无老化、钙化，且孕妇的乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、HIV、梅毒等传染性感染性疾病检测为阴性。
StemPro MSC SFM CTSTM培养基、胰蛋白酶、胶原酶Ⅱ（美国Gibco公司），无RNA酶的DNA酶（美国Promega公司），FITC（Fluorescein isothiocyanate）标记的CD45、CD14、CD19、HLA-DR和PE标记的CD34、CD73、CD105、CD90小鼠抗人单克隆抗体（美国BD公司），细胞茜素红染色试剂盒（上海纽杰美生物技术有限公司），油红O染色试剂盒（南京建成生物科技有限公司），成骨、成脂诱导分化试剂盒（美国Gibco公司），CCK-8检测试剂盒（日本同仁化学研究所）。流式细胞仪（美国BD公司），CO2培养箱（德国Advantage-Lab公司），手持电动匀浆器（美国PRO Scientific公司），倒置显微镜（日本NIKON公司）。
将获得的胎盘置于无菌盒中，加入500 ml生理盐水，转运至GMP（good manufacturing practice）实验室；无菌状况下，撕去胎盘羊膜，剪取胎盘绒毛膜成约1 cm条块状；在镊子挤压条件下，用生理盐水反复冲洗至澄清；镊子挤压干净血液和水份后，用电子天平称量，获得绒毛膜湿重。在样品中加入适量生理盐水，用手持电动匀浆器将样本处理至细小颗粒状（直径约2 mm），用生理盐水反复冲洗至澄清，接着用匀浆器处理至肉糜状（稍有颗粒感，能够用吸管自由吸取）；500 r/min离心5 min，去除上清液，沉淀中加入同体积的胰蛋白酶和胶原酶Ⅱ，于37 ℃，消化0.5~3 h。消化后的样品用生理盐水洗涤2次后，加入培养基，按照每T75培养瓶接种10 g绒毛膜组织的份量进行接种；培养瓶置于饱和湿度、37 ℃、体积分数为5%CO2的培养箱中静止培养7 d，置倒置显微镜下观察；倒出培养液（含未贴壁组织块），并用少量生理盐水冲洗培养瓶底，重新加入新鲜培养基，收集倒出的培养液和冲洗的生理盐水1 500 r/min离心5 min，沉淀中加入培养基，进行再次接种并静止培养7 d；倒出培养液，用少量生理盐水冲洗培养瓶底，重新加入新鲜培养基，收集再次培养倒出的培养液和冲洗的生理盐水1 500 r/min离心5 min，沉淀中加入培养基，进行第3次接种培养；待培养瓶中细胞生长到80%~90%融合状态时，用胰蛋白酶消化后按1∶2传代。
在接种后的7 d内需要保持培养瓶静止不动，此后每日在倒置显微镜下观察hpcMSCs的形态和生长情况，并记录拍照。
取P3代细胞，生理盐水冲洗后，用0.25%胰蛋白酶消化、1 500 r/min离心5 min，PBS（phosphate buffer saline）洗涤2次，调节细胞浓度为1×106/ml，取200 μl,分别加入流式抗体CD45、CD34、CD90、CD105、CD73、CD14、CD19、HLA-DR各10 μl，混匀后避光室温孵育30 min，用PBS洗涤2次，1 500 r/min离心5 min，重悬后进行流式细胞术检测和分析。
取P3代细胞，用培养基吹打成单细胞悬液，以2×104/cm2接种于96孔板上，设置7组，每组7孔，置于饱和湿度、37 ℃、体积分数为5%CO2的培养箱中培养；每24小时任意选择一组，加入10 μl CCK-8试剂，在细胞培养箱中孵育4 h后，酶标仪检测细胞吸光度值（激发波长450 nm）；用无细胞的培养基做空白对照，连续7 d，每天取7孔的吸光度均值绘制细胞生长曲线。
取P3代细胞，接种于24孔培养板，当细胞生长到80%融合度时，换成成骨或成脂诱导培养基，再分别诱导培养4周后，用茜素红染色试剂盒检测成骨诱导分化，用油红O染色试剂盒检测成脂诱导分化，分别用未加诱导分化培养基进行对照；倒置显微镜下观察分析和拍照。
用SPSS17.0统计软件进行数据分析处理，计量资料采用均值±标准差（
±s）表示，组间比较采用t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。
共处理胎盘30例，胎盘绒毛膜湿重为（104.57±9.56）g，3次培养共得到（18.33±1.77）瓶（T75培养瓶）P0代原代细胞。倒置显微镜下观察hpcMSCs贴壁生长，细胞形态为长梭形成纤维细胞样，呈平行或漩涡状生长（图1）。
初次培养、再次培养和第3次培养的收获时间分别是（12.00±0.64）、（8.87±0.63）、（12.33±0.80）d。统计结果表明，再次培养的收获时间与初次培养和第3次培养的收获时间差异有统计学意义（P<0.05），而初次培养的收获时间与第3次培养的收获时间差异无统计学意义（P>0.05），但是有收获时间延迟趋势。
每例胎盘绒毛膜经过3次培养后，共获得P0代细胞总数为（25.54±3.38）×106，各批次培养获得的细胞数差异有统计学意义（均P<0.05）。两两比较显示，再次培养与初次培养和第3次培养的每瓶获得细胞数差异均有统计学意义（均P<0.05），初次培养与第3次培养的每瓶获得细胞数差异无统计学意义（P>0.05），但是有细胞数减少趋势。（表1）
3次培养获得的P0代人胎盘绒毛膜间充质干细胞数比较（
±s）
3次培养获得的P0代人胎盘绒毛膜间充质干细胞数比较（±s）
| 培养批次 | 单瓶细胞数（×106） | 总细胞数（×106） |
|---|---|---|
| 初次培养 | 1.12±0.15a | 11.73±2.09ab |
| 再次培养 | 2.10±0.16b | 11.12±1.42b |
| 第3次培养 | 1.04±0.16 | 2.69±0.71 |
注：与再次培养相比，aP<0.05；与第3次培养相比，bP<0.05
P3代hpcMSCs表面抗体均呈现CD90、CD105、CD73的高表达，而CD34、CD45、CD14、CD19、HLA-DR不表达低表达，不同培养批次间差异无统计学意义（P>0.05）。（表2）
3次培养获得P3代人胎盘绒毛膜间充质干细胞的表面抗体阳性表达率（
±s，%）
3次培养获得P3代人胎盘绒毛膜间充质干细胞的表面抗体阳性表达率（±s，%）
| 培养批次 | CD34 | CD45 | CD14 | CD19 | HLA-DR | CD73 | CD90 | CD105 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 初次培养 | 0.81±0.12 | 1.24±0.10 | 1.21±0.15 | 0.11±0.09 | 1.15±0.24 | 100±0.00 | 99.17±0.14 | 99.71±0.09 |
| 再次培养 | 0.78±0.21 | 1.21±0.27 | 1.23±0.13 | 0.11±0.12 | 1.12±0.31 | 100±0.00 | 99.21±0.18 | 99.82±0.03 |
| 第3次培养 | 0.82±0.15 | 1.10±0.14 | 1.14±0.13 | 0.10±0.11 | 1.21±0.11 | 100±0.00 | 98.67±0.13 | 99.52±0.08 |
取各次培养的P3代hpcMSCs，用CCK-8法绘制生长曲线，3次培养获得细胞的生长曲线均呈"S"型，不同培养批次间差异无统计学意义（P>0.05）。（图2）
3次培养的P3代hpcMSCs经成骨、成脂分化培养基诱导4周后，分别用油红O或茜素红染色，结果均呈阳性。（图3）
20世纪70年代，Friedenstein等首先从成人骨髓中分离培养出间充质干细胞[5]。此后，学者们不断从其他组织如脂肪、牙髓、羊膜、绒毛膜、蜕膜、脐带、脐血等分离培养出间充质干细胞[6,7,8]。研究表明，间充质干细胞具有分化能力强、倍增时间短、具有免疫调节作用、低免疫原性、易于转染等特性，是再生医学领域中的一种理想种子细胞和基因治疗载体[1,2,3,4,9]。
目前，主要使用的骨髓间充质干细胞（human bone marrow mesenchymal cells, hbMSCs），虽然来源方便快捷，但仍具有以下缺陷[10]：①在骨髓中含量低（约0.1%~0.01‰），而且随着年龄增加，其扩增、分化能力和细胞数量呈现明显下降趋势。②伦理问题使其来源受到限制。③供者有不适感，接受度较差。④病毒感染机会大。hpcMSCs能替代hbMSCs并弥补其缺陷，受到再生医学领域的广泛关注[11,12,13]，主要因为：①取材几乎不受限制，胎盘为"废弃"物，只需在正常分娩的健康产妇知情同意，即可供给。②供者无痛苦，污染机会少。③hpMSCs更加原始，免疫原性更低，获得的原代干细胞数量大。④不涉及社会、伦理及法律方面的争论。
本研究中的30例样本中，胎盘绒毛膜的湿重均值为（104.57±9.56）g，初次培养接种（10.47±0.94）个T75培养瓶，再次培养接种（5.30±0.53）瓶，第3次培养接种（2.57±0.50）瓶，每例胎盘标本培养接种（18.33±1.77）瓶，基本按照10 g绒毛膜湿重接种1瓶T75培养瓶的份量，再次培养使用培养瓶数量为初次培养的50%，第3次培养所用的培养瓶数量为第2次培养的50%。用第3次培养的培养液和冲洗生理盐水进行第4次接种培养的过程中，发现贴壁细胞数量很少，生长较慢，不适合作为hpcMSCs分离培养体系的一部分，因此相关数据没有采用。
由于间充质干细胞没有明确、独特的鉴定标记，国际干细胞治疗学会定义了间充质干细胞的标准为[14]：①细胞贴壁生长。②表面标记CD90、CD105、CD73高表达，而CD34、CD45、CD14、CD19、HLA-DR的表达量低于2%。③能够诱导成骨、成脂、成软骨分化。本研究中，3次接种培养的细胞均符合该标准，其生长曲线、表面标记表达差异均无统计学意义，均能成骨、成脂分化，表明3次培养的细胞无差异。
本研究中，每例样本获得的总P0代总细胞数为（25.54±3.38）×106，其中初次培养获得P0代细胞最多，3次培养获得的细胞数之间差异有统计学意义（均P<0.05）。再次培养和第3次培养，可使获得的hpcMSCs数量翻倍，达到了提高产量的目的。初次培养获得P0代细胞数量最多，可能由于用酶消化后，有部分单细胞贴壁生长，形成集落，而对于微小组织块，由于组织新鲜，能够爬出来的细胞数量比较多[15]。
间充质干细胞是继造血干细胞之后，第2种应用于临床的干细胞。大型动物实验和临床应用中需要的细胞数量可达109数量级，因此如何大量获得间充质干细胞是研究的热点。已有研究用多次消化收集法、微载体悬浮培养法和组织块法的再次贴壁培养法提高了间充质干细胞的获得数量[16,17,18]。与这些方法比较，本研究中的方法更加简便快捷，每例胎盘绒毛膜组织可获得（25.54±3.38）×106个P0代间充质干细胞。
就每瓶的收获时间和收获细胞数而言，初次培养收获时间长，获得P0代细胞数量少。可能是初次培养时，细胞需要一个适应体外培养环境的过程，细胞从组织里爬出耗时较多。再次培养时，在初次培养过程中形成的某些黏附物质和生长因子能够促进组织贴壁和细胞生长，微小组织块经过7 d培养后，纤维组织松解，细胞易于爬出，收获时间缩短，可获得更多数量的P0代细胞。第3次培养时，由于长时间未贴壁，对细胞造成伤害，导致收获时间延长，收获细胞数量减少[19]。但该过程中的具体机制还有待进一步研究。
综上，本研究中提出的hpcMSCs培养方法增加了P0代细胞的获得数量，提高了样本利用率，为建立临床级hpcMSCs库，以及为组织工程和基因治疗载体提供充足的、质量稳定可靠的间充质干细胞提供技术基础。
利益冲突 无
