探索介质阻挡放电（DBD）等离子体对肿瘤细胞的杀伤作用并分析其凋亡机制。
利用噻唑蓝（MTT）检测低温等离子体在不同作用时间下对正常脾脏白细胞和大鼠急性早幼粒白血病细胞（LT-12）细胞毒性的影响，检测等离子体处理后细胞内活性氧（ROS）含量的变化，利用Annexin V/PI双染法检测不同作用时间剂量下细胞凋亡情况，实时荧光定量PCR和Western Blot检测相关凋亡基因和蛋白的表达变化。
MTT结果表明，等离子体对细胞的杀伤呈作用时间剂量和时间依赖性，随着作用时间从30 s到240 s，处理8 h后细胞的存活率从98%降至63%。在相同作用时间下，如240 s，细胞的存活率从2 h的78%降至24 h的39%；Annexin V/PI双染法结果显示，等离子体作用可引起细胞凋亡，凋亡率不仅与等离子体作用时间剂量呈正相关，还与作用后的时间相关，等离子体处理后时间越长，其凋亡率越高，如处理12 h后，细胞的凋亡率从60 s的48%增至120 s的55.3%；流式细胞仪检测的ROS的产生也显示了时间相关性，等离子体作用后其ROS立即增至1.24倍，至20 h急剧增高至5.39倍；qRT-PCR和Western Blot的实验结果表明，在等离子体处理后8~12 h Caspase家族和Bcl-2家族基因和蛋白表达非常活跃。
本研究表明低温等离子体能有效杀伤肿瘤细胞，凋亡是其主要的致死机制，并初步阐述了低温等离子体促进肿瘤细胞凋亡的分子机制。
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等离子体是除固体、液体、气体以外的物质的第4种状态。目前，低温等离子体在生物医学领域的应用日益成为热点话题，已受到生物学家、物理学家和医务工作者的高度关注。等离子体中含有大量活性氧（reactive oxygen species, ROS）、活性氮（reactive nitrogen species, RNS）及其他短寿命或长寿命的活性物质，如O、O2、O2-、OH、NO和NO2[1,2]。
大量相关研究表明，常压低温等离子体能对医疗器械、生物材料、食品包装材料等进行有效的消毒灭菌[3]，对生物组织可起到快速凝血作用[4]，并可用于牙齿的消毒和龋齿的治疗[5,6]。最近的研究发现，等离子体可杀伤肿瘤细胞，已成为一种肿瘤治疗的新方法。目前，已发现低温等离子体对脑肿瘤、口腔癌、卵巢癌、皮肤黑色素瘤等均具有较强的抑制作用[7,8,9,10,11]。Keidar等[12]使用低温等离子体对人支气管上皮细胞（HBE）、肺癌细胞株（SW900）进行处理时发现，等离子体对肺癌细胞具有杀伤作用，而对人支气管上皮细胞并无损害。Kim等[13]采用常压等离子射流处理体外培养的人乳腺癌细胞（MCF-7），出现了明显的凋亡。
尽管最新研究报道等离子体能诱导肿瘤细胞死亡，然而有关细胞死亡的分子机制尚不明确，等离子体的剂量与杀伤细胞的机制之间的关系尚无报道，因此本研究以大鼠急性髓系白血病细胞系LT-12为细胞模型，研究介质阻挡放电（dielectric barrier discharge, DBD）低温等离子体在不同作用时间剂量下对白血病细胞活性的影响，并观察作用后不同时间细胞凋亡的发生和凋亡基因和蛋白的变化，旨在初步阐述低温等离子体促进肿瘤细胞凋亡的分子机制。
实验所用大鼠急性髓系白血病细胞系LT-12（荷兰Masterns教授所赠），RPMI-1640培养基（美国Hyclone公司），胎牛血清（美国Gibco公司），磷酸盐缓冲液、噻唑蓝（thiazolyl blue tetrazolium bromide, MTT）、十二烷基硫酸钠-二甲基甲酰铵（SDS-DMF）（美国Sigma公司），RNeasy Plus Mini Kit RNA提取试剂盒（德国Qiagen公司），Hoechst33342染色液、Annexin V-Alexa Fluor 488/PI凋亡检测试剂盒、活性氧试剂盒、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）快速配制试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），SYBR GREEN qPCR mix（北京康为世纪生物科技有限公司），qRT-PCR引物（美国Invitrogen公司），凋亡抗体检测试剂盒（美国Cell Signaling Technology （CST）公司）。
CTP-2000K等离子体反应器（南京苏曼等离子科技有限公司），C6流式细胞仪（美国BD公司），IN Cell Analyzer 2000高内涵细胞成像分析系统（美国GE公司），ABI 7500实时PCR仪（美国Applied Biosystems公司）、Varioskan Flash酶标仪（美国ThermoFisher Scientific公司），FLIRI3红外测温仪（美国FLIR公司）。
CTP-2000K等离子体反应器装置实物图如图1A，主要由CTP-2000K电源主机、调压器和介质阻挡放电实验装置组成。设备原理图如图1B所示，等离子反应器由上下两个电极组成，电极直径为50 mm；2片石英玻璃作为介质，介质直径为90 mm，厚度为1 mm，石英玻璃介质间距为6 mm；电源输出频率为10 kHz，电流检测端口的取样电阻为50 Ω。实验中，调压器的输入电压为18 V，电流为1.6 A。
LT-12细胞采用含有10%灭活胎牛血清的RPMI-1640培养液（含有双抗：质量浓度为100 μg/ml青霉素、100 μg/ml链霉素），置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱内培养。每2~3天传代一次，取对数生长期细胞进行实验。实验时，离心去上清，用培养液制成单细胞悬液，计数，调整细胞密度为1×105~1×106/ml，取细胞悬液2 ml接种在直径35 mm的培养皿中，用于其后实验。
将含有白血病细胞LT-12细胞悬液的培养皿（细胞浓度为2×105/ml）置于等离子体反应器的两个电极之间，分别用等离子体作用0、30、60、90、120、240 s后放进培养箱继续培养。
经等离子体作用后的细胞，分别培养2、4、6、8、12、16、20、24 h后加入质量浓度为5 mg/ml的MTT溶液后继续培养4 h；然后加体积分数为10%~50%的二甲基甲酰胺（DMF）过夜溶解。于酶标仪570 nm处检测吸光度（A）值。按照以下公式计算细胞的存活率（S）
经等离子体处理90 s后的细胞，分别于0、2、4、6、8、12、14、16、18、20、22、24 h后加入5 μmol/L的2′，7′-二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH-DA）处理，随即用C6流式细胞仪检测二氯荧光素（dichlorofluorescein, DCF）的荧光强度。
分别收集低温等离子体处理60、90、120 s后培养8、12 h的细胞，将含有Annexin V-Alexa Fluor 488、PI及含有细胞的Binding Buffer混合液混匀后加入细胞于室温避光孵育15 min，随即于C6流式细胞仪在激发波长488 nm处进行检测。
取等离子体处理后的细胞（处理方法同1.2.5），离心去上清，PBS重悬，加入含有Annexin V-Alexa Fluor 488、PI、Hoechst33342的混合液于室温孵育15 min，PBS洗涤后，1 500×g离心30 s，使细胞贴壁，于高内涵细胞成像分析系统分析样品，其中Annexin V-Alexa Fluor 488、PI、Hoechst33342的激发波长分别为490/20、543/22、400/50 nm，相应的发射波长分别为525/30、605/64、455/50 nm。
取处理过程如1.2.5的细胞培养皿，使用RNeasy Plus Mini Kit RNA提取试剂盒提取细胞中的RNA，反转录为cDNA；随后以cDNA为模板，使用ABI 7500实时定量PCR仪扩增目的基因片段，结果用ΔΔt方法进行计算。其中变性温度为95 ℃，退火温度60 ℃，延伸温度72 ℃进行反应，进行35~40个循环。引物名称及相关序列号如表1。
引物名称及相关序列号
引物名称及相关序列号
| 引物名称 | 引物序列（5'→'3） |
|---|---|
| Casp3-Rat-F | CCTGTGATTGGAGAGAAGATGG |
| Casp3-Rat-R | GGTTCAGTCTCATGTGGTAACT |
| Casp8-Rat-F | CTGACTGGCGTGAACTATGA |
| Casp8-Rat-R | CATCAGTTAGGAGGGAAGAAGAG |
| Bcl2-Rat-F | TACGAGTGGGATACTGGAGATG |
| Bcl2-Rat-R | TCAGGCTGGAAGGAGAAGAT |
| Bid-Rat-F | TACGTGAGGGACTTGGTTAGA |
| Bid-Rat-R | GCTTCACAATTCTTGCCGTATC |
取处理过程如1.2.5的细胞培养皿，收集细胞，加RIPA buffer裂解细胞混匀，12 000×g离心5 min。通过蛋白质凝胶电泳、转膜、封闭、杂交及显色等一系列步骤检测目的蛋白的表达。其中内参为β-actin，一抗稀释比例为1∶3 000，二抗稀释比例为1∶5 000。
应用SPSS22.0统计学软件进行统计分析，实验数据以均值±标准差（
±s）表示，采用单因素方差分析，独立的实验结果比较采用t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。
LT-12细胞经不同剂量的等离子体处理后，分别培养2、4、6、8、12、16、20、24 h并检测细胞的活性。如图2A所示，当处理时间为240 s时，细胞的存活率从2 h的78%下降到24 h的39%。当在8 h后检测时，发现细胞的存活率从30 s的98%下降到240 s的63%，说明等离子体对白血病细胞LT-12的杀伤效应具有明显的时间依赖性和作用时间剂量依赖性，12 h后细胞杀伤速率显著增加，表明等离子体杀伤肿瘤细胞不是一个快速和即时的过程。
在处理过程中，笔者使用红外测温仪对培养液的温度变化进行了监测（图3）。结果表明，培养液温度从处理时间为30 s的23.9 ℃上升到240 s的31.7 ℃。表明在实验设定剂量条件下可忽略热效应对细胞的杀伤影响。
此外，笔者以同样的方法和作用时间对正常的脾脏白细胞进行处理（图2B），发现细胞存活率维持在80%左右。说明在实验剂量下，等离子体对正常白细胞无明显杀伤作用。
DCFH-DA可间接地检测细胞内活性氧（ROS）的变化，实验持续监测了等离子体处理后24 h内的细胞内DCF荧光强度（图4）。结果如图所示，等离子体处理细胞90 s，分别于处理后0、2、4、6、8、12、14、16、18、20、22、24 h检测DCF荧光强度。等离子体经处理后其ROS含量立即升高，是处理前的1.24倍，并缓慢持续增加；至20 h时，ROS急剧升高至处理前的5.39倍，至24 h时已达到处理前的13.88倍，其差异具有统计学意义（P<0.05）。
与等离子体处理前比较，aP<0.05
使用Annexin V/PI双染检测等离子体处理后细胞凋亡率，通过流式细胞仪区分活细胞（Annexin V-/PI-）、早凋（Annexin V+/PI-）、晚凋（Annexin V+/PI-）和坏死细胞（Annexin V-/PI+）的百分比（图5A）。结果如图所示，等离子体分别处理细胞60、90、120 s后，分别于8、12 h后使用流式细胞仪通过Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡。处理后8 h，细胞的凋亡率从60 s的23.8%增加到了120 s的28%；处理12 h后，细胞的凋亡率从60 s的48%增至120 s的55.3%，可见等离子处理后细胞凋亡率显著增加，并呈现一定的作用时间剂量相关与处理后的时间相关。
等离子体处理细胞60、90、120 s后，分别于培养8、12 h后收集细胞
同时，笔者通过高内涵细胞成像分析系统观察细胞凋亡图像（图5B），结果如图所示，等离子体处理后，用Annexin V-Alexa Fluor 488、PI、Hoechst33342共同孵育细胞，通过高内涵成像分析系统观察细胞图像。在8 h组，笔者看到少量红色的细胞核和绿色的细胞膜；而在12 h组，能看到大量红色的细胞核，说明细胞处于凋亡晚期或者坏死。通过软件计算凋亡率结果与流式分析结果基本一致，表明等离子体处理确实激发了白血病细胞的凋亡反应。
等离子体处理以后，4种凋亡相关的基因——Caspase-3、Caspase-8、Bcl-2、Bid被检测（图6）。如图所示，等离子体分别处理细胞60、90、120 s后，分别于8、12 h后收集细胞，进行qRT-PCR实验。3次独立的实验结果采用t检验，证明等离子体处理后8 h，随着等离子体剂量增加（60、90、120 s），基因Caspase-3的表达量分别是未处理组（对照组）的2.57倍、2.85倍、3.70倍，而Caspase-8和Bid基因的表达量也是随处理时间的增加而增大。Bcl-2作为抗凋亡基因，其表达水平在90 s抑制作用最强，与对照组比较其差异有统计学意义（P<0.05）。12 h时基因的表达与之相似，但Bid表达不再活跃。
等离子体处理细胞60、90、120 s后，分别于培养8、12 h后收集细胞。与对照组比较，aP<0.05
Caspase通路的激活是细胞凋亡过程中的关键事件，Caspase-9是起始者，Caspase-3、Caspase-7为执行者，PARP为下游执行者。Caspase-9与Caspase-3在Caspase级联反应中分别在起始者与执行者上处于核心地位，是细胞凋亡发生的关键步骤及一切凋亡信号传导的共同通路（图7）。如图所示，等离子体分别处理细胞60、90、120 s后，分别于8、12 h后收集细胞，使用Western Blot方法检测Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-7、Cleaved Caspase-9和Cleaved PARP蛋白的表达，β-actin作为对照组。当处理后8 h，剂量从60 s增加到120 s时，Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-7、Cleaved Caspase-9和Cleaved PARP的表达量相比对照组逐渐增加；当处理后12 h，剂量从60 s增加到120 s时，Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-7、Cleaved Caspase-9和Cleaved PARP的表达量也是增强的；且总体来说，12 h组的表达量强于8 h组。
C—对照组；1—8 h-60 s；2—8 h-90 s；3—8 h-120 s；4—12 h-60 s；5—12 h-90 s；6—12 h-120 s
低温等离子体因其温度低、生物化学性质活泼等特点，近年来在生物医学中的应用备受瞩目。等离子体内部电子的能量较高，可使反应物分子激发、解离和电离，成为活泼的反应物种，其中含有多种不同的活性成分，如紫外线（UV）、带电粒子（电子、正负离子）、化学活性粒子活性氧（ROS）和活性氮（RNS）等活性物质，这些活性物质能够与细胞反应并诱导细胞凋亡。细胞凋亡主要有3条途径，即死亡受体诱导的外源性途径、线粒体凋亡通路介导的细胞凋亡的内在途径以及内质网通路途径[14]。
低温等离子体诱导细胞凋亡过程中，作用时间剂量和作用后的时间扮演着重要的角色。Barekzi和Laroussi[15]发现，等离子体的作用效果不是即时的，而是有延迟的；并且杀伤率随着作用时间剂量的增加而增大，在等离子体处理12 h及以后，处理时间剂量3 min以上时，杀伤效果很明显。笔者认为其原因可能是随着等离子体作用时间剂量的增加，产生的活性物质的浓度增加，进而激活细胞内的凋亡信号通路，最后促进细胞程序性死亡。在本研究的MTT实验中，当处理后8 h及以后、作用时间剂量60 s以上时，等离子体对白血病细胞的杀伤作用才逐渐明显，从而证实了等离子体的杀伤效应不是即时的。同时笔者通过持续监测等离子体处理后的细胞内ROS含量，发现随着时间的延长，细胞内ROS含量逐渐升高，于处理后24 h时出现急剧升高，已达到处理前的13.88倍。流式细胞仪实验结果表明，随着等离子体作用时间剂量的逐步增加（60、90、120 s），在等离子体处理后继续培养8 h，细胞分类中活细胞比例分别为74%、65.3%、57.2%；而在同样的剂量下，处理后12 h组的活细胞比例比8 h组更低，进一步说明了等离子体对肿瘤细胞的杀伤效应呈现出明显的时间依赖性和作用时间剂量依赖性。
Caspase家族成员和Bcl-2家族成员在等离子体诱导细胞凋亡中扮演着重要的角色。Kim等[16]研究发现，等离子体能够活化凋亡刽子手—Caspase-3，促进细胞色素C从线粒体中释放，并使膜电位发生明显改变的Caspase家族可直接导致细胞凋亡解体，使其在细胞凋亡机制网络中处于中心地位。Caspase-9与Caspase-3在Caspase级联反应中分别在起始者与执行者上处于核心地位，PARP在DNA损伤修复与细胞凋亡中发挥着重要作用，是细胞凋亡发生的关键步骤及一切凋亡信号传导的共同通路。为进一步探究等离子体对LT-12细胞的杀伤机制，笔者检测了等离子体介导后的几个常见凋亡相关基因和蛋白的表达水平。结果显示，随着等离子体剂量的增加，大部分基因如Caspase-3、Caspase-8及Bid表达量明显上升，活化的Caspase-3、Caspase-7、Caspase-9和PARP的表达量逐渐增加，120 s组活化蛋白表达最强，且处理后12 h组明显强于8 h组。本研究结果表明，经过等离子体处理的LT-12细胞，其Caspase家族蛋白被激活，互相联系共同调节，致使细胞内复杂的凋亡信号通路被激活，最终促进细胞凋亡。
利益冲突 无
