利用CRISPR-Cas9基因编辑技术验证与非小细胞肺癌转移相关的Trim72基因的敲除是否引起肝癌转移能力的变化。
建立稳定表达Cas9蛋白的小鼠肝癌细胞系Hepa1-6（Cas9），随后利用针对Trim72基因的单导向RNA（sgRNA）进行特异性基因敲除获得Hepa1-6（Trim72-KO）细胞系，再通过体外Transwell实验和体内皮下瘤肺转移检测评估该细胞系的迁移和侵袭能力。
利用CRISPR-Cas9系统成功获得了Hepa1-6（Trim72-KO）细胞系。Transwell实验结果表明，敲除Trim72基因后，Hepa1-6（Cas9）细胞系的体外迁移和侵袭能力增强；体内皮下瘤肺转移病理检查结果显示，Hepa1-6（Trim72-KO）细胞系（实验组）所成皮下瘤的体内转移能力明显强于未转入相应sgRNA的Hepa1-6（Cas9）细胞系（对照组）。
通过CRISPR-Cas9系统成功获得了敲除Trim72基因的Hepa1-6（Trim72-KO）细胞系，该细胞系表现出较Hepa1-6（Cas9）细胞系更强的侵袭和转移能力，说明Trim72基因可能在肝癌的侵袭和转移中起重要作用，有望成为肝癌基因治疗的潜在靶点。
版权归中华医学会所有。
未经授权，不得转载、摘编本刊文章，不得使用本刊的版式设计。
除非特别声明，本刊刊出的所有文章不代表中华医学会和本刊编委会的观点。
CRISPR-Cas9系统的出现为基因编辑提供了快捷有效的新工具。具有核酸内切酶活性的Cas9蛋白与单链的单导向RNA（single guide RNA, sgRNA）组成的复合体能特异识别3'末端带有前间区序列邻近基序（protospacer adjacent motif，PAM）序列的DNA双链，随后Cas9对靶DNA双链进行切割，使PAM区产生双链缺口，引起同源重组修复或非同源末端连接，最终引起基因组特定位点发生部分序列的插入/缺失，从而干扰基因的表达[1]。结合高通量sgRNA文库，CRISPR-Cas9系统可实现全基因组范围的基因功能缺失筛选。研究人员将基于CRISPR-Cas9系统的全基因组筛选应用于肿瘤研究领域，鉴定出一系列与肿瘤生长和转移相关的基因。其中，Chen等[2]研究发现，Trim72等基因的敲除可引起非小细胞肺癌转移能力的增强。关于Trim72蛋白的前期研究结果表明，其参与肌细胞损伤后的膜修复过程，并在心脏缺血/再灌注损伤中起到保护作用[3,4,5]，但鲜有研究阐述其在肿瘤转移中所发挥的作用。为进一步研究Trim72蛋白与肿瘤转移的关系，笔者利用CRISPR-Cas9系统在小鼠肝癌细胞系Hepa1-6中敲除Trim72基因，并对获得的Hepa1-6 （Trim72-KO）细胞系的转移能力进行体外和体内验证，为寻找肝癌基因治疗的新靶点奠定基础。
小鼠肝癌细胞系Hepa1-6、人胚肾细胞系239FT、大肠杆菌DH5α感受态细胞、lentiCas9-Blast载体、lentiGuide-Puro载体、限制性内切酶Esp3Ⅰ、限制性内切酶XhoⅠ、T4 DNA连接酶、胶回收试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司），质粒大提试剂盒（德国QIAGEN公司）、质粒小提试剂盒（美国Promega公司），胎牛血清（美国Invitrogen公司），包氏液（美国Sigma-Aldrich公司），伊红、苏木素（北京中杉金桥生物技术有限公司），酵母提取物、蛋白胨、琼脂糖（北京索莱宝科技有限公司），引物合成及测序（深圳华大基因科技服务有限公司）。健康清洁级4~6周龄C57BL/6雄性小鼠6只，体质量20~25 g，购于南京模式动物研究所，许可证号为SCXK（苏）2015-0001。
RM2235石蜡切片机、EH1150H石蜡包埋机（德国Leica公司），MyCycler PCR仪（美国Bio-Rad公司），Tanon1600凝胶成像系统（上海天能科技有限公司），BX51正置荧光显微镜、IX71倒置荧光显微镜（日本Olympus公司），DK-8D恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司），NanoDrop 2000c分光光度计（美国Thermo Fisher Scientific公司）。
根据CRISPR-Cas9靶点设计原则设计靶向小鼠Trim72基因的sgRNA，该sgRNA的可变区序列由2段寡核苷酸链复性退火生成。其中，MTrim72-F：5'-caccgGCTGTTCGATGCGCCAGTGA-3'；MTrim72-R：5'-aaacTCACTGGCGCATCGAACAGCC-3'。
LentiCas9-Blast质粒经酶切验证后，大提质粒进行慢病毒包装，随后用浓缩后的Cas9病毒液感染小鼠肝癌细胞系Hepa1-6。再经杀稻瘟菌素（blasticidin, BSD）抗性筛选1周后提取细胞基因组，并使用针对编码Cas9序列的引物对基因组进行扩增。将获得的条带纯化后进行Sanger法测序，测序引物为Cas9序列上游扩增引物。将测序结果与Cas9的编码序列进行比对，进而验证细胞系中是否已转入Cas9蛋白编码序列。
①酶切lentiGuide-Puro载体。反应体系为载体5 μg，内切酶Esp3Ⅰ（BsmBⅠ）3 μl，热敏感碱性磷酸酶（FastAP）3 μl，10×酶切缓冲液6 μl，二硫苏糖醇0.6 μl，用水补足至60 μl。将上述体系37 ℃水浴2 h。②载体片段胶回收。将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，可见1条约2 kb片段及1条约7 kb片段，切胶、胶回收7 kb的片段，用分光光度计测DNA浓度。③插入片段复性。反应体系为10 μmol/L的MTrim72-F引物与10 μmol/L的MTrim72-R引物各10 μl。反应条件为95 ℃、5 min，随后每30秒降1 ℃，直至降至4 ℃。④连接。反应体系为7 kb载体胶回收产物50 ng，插入片段复性产物3 μl，T4 10×酶切缓冲液2 μl，T4连接酶0.2 μl，加水补足至20 μl。反应条件为22 ℃、1 h，65 ℃、10 min，4 ℃、无限。⑤转化。将5 μl连接产物加入50 μl大肠肝菌DH5α感受态细胞中，冰浴36 min，42 ℃水浴热击45 s，冰上放置3 min；加250 μl LB液体培养基，于摇床37 ℃、200 r/min培养1 h；涂板，正置30 min，倒置过夜。⑥菌体PCR。以设计的sgRNA可变区上游引物及MTrim72-R扩增载体序列，检测挑取的菌落是否插入sgRNA可变区。观察菌板生长情况，挑取单个菌落，标号1、2、3……。将每个标号的菌落挑至加有10 μl LB液体培养基中制成菌悬液，混匀。菌体PCR体系如下：菌悬液1 μl，Taq酶5 μl，上游引物0.5 μl，下游引物0.5 μl，水补足至10 μl。反应条件如下：95 ℃、10 min，1个循环；95 ℃、30 s，58 ℃、30 s，72 ℃、1 min，35个循环；72 ℃、10 min，4 ℃、无限。对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，选取正确条带对应的菌液进行摇菌。⑦摇菌。取6 ml LB液体培养基、6 μl氨苄青霉素和4.5 μl菌液，于摇床37 ℃、240 r/min培养过夜。⑧酶切验证。保存菌液，小提质粒，酶切体系为质粒0.5 μg，内切酶XhoⅠ 0.2 μl，10×酶切缓冲液0.5 μl，水补足至5 μl，于37 ℃水浴20 min。将构建的质粒与原始质粒一起用XhoⅠ酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，构建成功的质粒经XhoⅠ酶切后会较原载体经XhoⅠ酶切后小2 kb左右。对电泳结果正确的质粒进行测序验证，测序引物为人源U6启动子上游引物。测序完成后进行病毒包装及感染。
将1×105个Hepa1-6（Cas9）细胞用500 μl sgRNA病毒液重悬至24孔板中，同时加入1/1 000的聚凝胺促进感染；12 h后换成正常培养基，48 h后用嘌呤霉素（2 mg/ml）抗性筛选1周，提取细胞基因组，并扩增Trim72基因中sgRNA所靶向的片段，测序验证靶点处是否引入突变。若PAM区附近开始出现套峰，则证明该细胞系中Trim72基因已发生突变，建系成功。
在24孔板中加入500 μl DMEM培养基（含体积分数为10%的胎牛血清）并置入Transwell小室；向上室中加入1×105个细胞（对照组加入Hepa1-6（Cas9）细胞系，实验组加入Hepa1-6（Trim72-KO）细胞系）及200 μl无血清DMEM培养基，于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养12~24 h；取出培养板，弃去上室液体，小心取出上室，用棉签擦去膜上未穿过膜的细胞；向上室中加入500 μl质量浓度为40 g/L的多聚甲醛溶液固定10 min，磷酸盐缓冲液洗2次，每次10 min；加入100%甲醇活化10 min，磷酸盐缓冲液洗2次，每次10 min；加入质量浓度为1 g/L的结晶紫染液染30 min，磷酸盐缓冲液洗2次，每次10 min；弃液，晾干，于倒置显微镜下观察并拍照。
C57BL/6小鼠于动物室内分笼喂养，室内温度为22~26 ℃，相对湿度为40%~60%，明暗交替时间12 h，自由进食饮水。将C57BL/6小鼠按随机数字表法分为2组，每组3只。实验组小鼠右后背皮下接种1×107个Hepa1-6（Trim72-KO）细胞，对照组小鼠接种1×107个Hepa1-6（Cas9）细胞，正常喂食喂水，定期观察小鼠身体状态。种植皮下瘤67 d后，处死小鼠，取其肺组织置于包氏液中进行固定；次日取出组织，用刀片切成两边平面厚度均在1 cm以内的组织切片，置于15 ml离心管中，用自来水洗去包氏液；将组织置于标记好的包埋盒中，按体积分数为70%的乙醇30 min→85%乙醇30 min→95%乙醇30 min→无水乙醇30 min进行梯度脱水；放于通风橱内的二甲苯中透明40 min；将固态石蜡放入80~90 ℃水浴锅内化蜡，同时准备烘箱；将透明完成的包埋盒浸于液体石蜡中，在65 ℃烘箱中浸蜡6 h；提前预热石蜡包埋机30 min，将包埋盒取出放在包埋机上，将组织置于铁盒模具中，滴入石蜡浸没组织，调整好组织的位置，快速冷却，再盖上包埋盒标有名字的一端，滴满石蜡，置于4 ℃冷却机上约2 h，即可置于4 ℃冰箱保存。次日，石蜡切片，于55 ℃烤片机上烤片，2 h后收片。继续对肺组织进行病理染色（苏木精-伊红染色），先将玻片架置于通风橱内的二甲苯中透明40 min；按无水乙醇5 min→95%乙醇5 min→85%乙醇5 min→70%乙醇5 min梯度水化，于蒸馏水中润洗5 min；将石蜡切片置于苏木素染缸中染色13 min，然后置于装有自来水的烧杯中终止返蓝，轻轻摇晃至组织基本变蓝；再置于伊红染缸中染色1 min，于蒸馏水中终止；按70%乙醇10 s→85%乙醇10 s→95%乙醇1 min→无水乙醇3 min梯度脱水；于二甲苯中透明5 min；中性树胶封片，同时轻轻按压挤出气泡，通风橱内晾干后于正置荧光显微镜下观察拍照。
采用SPSS17.0统计学软件处理数据，正态分布的计量数据以均值±标准差（
±s）表示，组间均值比较采用独立样本t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。
首先将验证正确的lentiCas9-Blast质粒（图1）进行病毒包装，然后利用浓缩后的lentiCas9-Blast病毒感染小鼠肝癌细胞系Hepa1-6，再使用质量浓度为20 mg/ml的BSD抗性筛选1周后提取细胞基因组，并对细胞系进行鉴定（图2）。结果显示，感染lentiCas9-Blast病毒的Hepa1-6（Cas9）细胞系具有BSD抗性，经BSD杀伤后的存活力较Hepa1-6细胞系强（图2A）。对Hepa1-6（Cas9）细胞系基因组中的Cas9编码片段进行扩增，获得了与预期相符的387 bp条带（图2B），测序结果显示，该条带的序列与Cas9蛋白的编码序列一致（图2C）。证明已成功建立了稳定表达Cas9蛋白的细胞系。
笔者设计了用于敲除Trim72基因的sgRNA，其可变区序列为5'-GCTGTTCGATGCGCCAGTGA-3'。Hepa1-6（Cas9）细胞系感染sgRNA病毒后，使用质量浓度为2 mg/ml的嘌呤霉素进行抗性筛选1周后提取细胞基因组，扩增Trim72基因中含有sgRNA结合位点的片段，测序验证靶点处是否引入突变。测序结果显示，PAM区附近开始出现套峰，说明Trim72基因已发生突变，Hepa1-6（Trim72-KO）细胞系已成功建立。（图3）
为了验证敲除Trim72基因对肝癌细胞迁移和侵袭能力的影响，笔者首先进行了体外Transwell实验。结果如图4所示，Hepa1-6（Trim72-KO）细胞系（实验组）的迁移细胞数明显高于Hepa1-6（Cas9）细胞系（对照组），差异具有统计学意义（P<0.05），表明Trim72基因的敲除可引起肝癌细胞体外迁移和侵袭能力的提高。
对照组—Hepa1-6（Cas9）细胞系；实验组—Hepa1-6（Trim72-KO）细胞系
将Hepa1-6（Trim72-KO）细胞与Hepa1-6（Cas9）细胞各1×107个分别接种于C57BL/6小鼠右后背部。种植皮下瘤67 d后，处死小鼠，取其肺组织置于包氏液中进行固定，并进行石蜡包埋、切片以及苏木精-伊红染色。病理分析结果显示，皮下接种Hepa1-6（Trim72-KO）细胞的小鼠肺部可见明显转移病灶，而接种Hepa1-6（Cas9）细胞的小鼠未见明显肺转移，说明Trim72基因的敲除同样可促进肝癌细胞的体内转移。（图5）
对照组小鼠接种Hepa1-6（Cas9）细胞系；实验组小鼠接种Hepa1-6（Trim72-KO）细胞系
肿瘤的发生发展是一个复杂的过程，是由多种致癌因素综合作用的结果，涉及多基因、多通路的共同参与[6]。基因编辑技术在基因功能研究中发挥着重要作用。目前，熟知的有锌指核酸酶、类转录激活因子效应物核酸酶及研究运用较多的CRISPR-Cas9系统[7]。其中，设计简易操作方便的当属CRISPR-Cas9系统。
CRISPR-Cas9系统是一类广泛存在于细菌和古生物菌体内的免疫防御机制，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。其主要构成有CRISPR和Cas蛋白[8,9,10]。该系统已在小鼠、大鼠、斑马鱼甚至人类细胞中实现了基因组定点修饰[11]。Cas9蛋白带有核定位信号，能使sgRNA与其结合并组装成sgRNA-Cas9复合物，从而可切割带有5'-NGG的PAM，实现对靶基因DNA的特异切割[12]。
Trim72基因属于TRIM家族，又名MG53，其在心肌和骨骼肌中大量表达[13]。关于Trim72蛋白的前期研究结果表明，其参与肌细胞损伤后的膜修复过程,并在心脏缺血/再灌注损伤中起保护作用[3,4,5]。Trim72是一种E3泛素连接酶，可引起胰岛素受体和胰岛素受体底物1的降解，继而导致胰岛素抵抗和代谢性疾病[14,15,16]。Trim72基因在肿瘤发生与转移中的功能研究鲜见报道，但近期研究结果发现，Trim72基因的敲除可引起非小细胞肺癌转移能力的增强[2]。为进一步明确该基因在肿瘤转移中的作用，笔者利用CRISPR-Cas9系统建立了特异性敲除Trim72基因的肝癌细胞系Hepa1-6（Trim72-KO）。本研究结果表明，Trim72基因的敲除同样可引起肝癌细胞体外迁移及体内转移能力的增强。Trim72基因能抑制非小细胞肺癌和肝癌的转移，是一个潜在的肿瘤转移抑制基因，有望成为肝癌基因治疗的新靶点。
无
