模拟颅脑创伤（TBI）后的化学微环境，探讨该微环境对神经干细胞（NSCs）存活和分化的影响。
获取TBI大鼠损伤区脑组织的匀浆液，用于模拟TBI后的化学微环境。分离、提取并培养大鼠原代NSCs，采用免疫荧光染色鉴定其表型。将实验分为对照组、正常脑组织提取液组（BTE组）和创伤脑组织提取液组（TBITE组）。动态观察各组细胞的生长情况和形态变化，24 h后行Western Blot检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3及Cleaved caspase-3的表达水平；3 d后采用噻唑蓝实验和Western Blot检测NSCs的增殖情况；7 d后行免疫荧光染色检测NSCs向神经元分化的水平。
Western Blot结果显示，与对照组相比，BTE组无明显细胞凋亡变化，而TBITE组NSCs凋亡显著增多，Bax（F=18.06，P<0.01）和Cleaved caspase-3（F=23.86，P<0.01）表达升高，Bcl-2表达降低（F=22.95, P<0.01），差异均具有统计学意义。噻唑蓝实验结果显示，与BTE组相比，TBITE组NSCs增殖水平降低（F=41.99, P<0.01），差异具有统计学意义。免疫荧光染色结果显示，与对照组相比，BTE组神经元分化率升高；而与BTE组相比，TBITE组神经元分化率降低（F=66.93，P<0.01），差异均具有统计学意义。
TBI后的损伤微环境可显著抑制NSCs的存活和分化能力，从而为明确TBI后内源性神经的再生机制提供了理论基础。
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颅脑创伤（traumatic brain injury，TBI）具有发病急骤、高致死率和高致残率的特点，已成为世界性的公共卫生问题。目前，临床上对TBI的治疗仍缺乏有效措施[1,2]。传统观念认为，损伤后的中枢神经系统不具备神经再生的能力。1992年，Reynolds和Weiss[3]从成年小鼠纹状体中分离得到能在体外不断增殖并具有多种分化潜能的细胞群——神经干细胞（neural stem cells，NSCs）。成体NSCs的发现打破了传统观念，干细胞替代疗法更为神经修复开辟了一条新途径。然而，许多研究结果显示，中枢神经系统损伤后，损伤区微环境是影响NSCs移植的关键[4,5]。在TBI早期，创伤局部神经元的死亡、脑水肿、大量炎症因子的释放及Ca2+内流等一系列生化过程，可触发神经元凋亡级联反应，从而导致神经元进行性变性坏死[6,7]。如何维持创伤后神经元的存活以及促进神经元再生是一个关键性问题。近年来的研究结果表明，TBI后神经元的存活及再生依赖于适宜的微环境。因此，需要明确TBI后病理微环境对NSCs存活、增殖和分化的影响，从而为干细胞疗法的应用奠定基础。本研究通过使用TBI大鼠脑组织匀浆模拟TBI后化学微环境的变化，旨在探讨NSCs在该环境下的增殖、凋亡和分化能力，以评估NSCs对TBI损伤区微环境的适应能力。
健康无特定病原体级2.5月龄Sprague-Dawley雄性大鼠4只（体质量250~300 g）及健康无特定病原体级孕14 d Sprague-Dawley雌性大鼠2只（体质量350~400 g）均购于北京军事医学科学院动物实验中心，许可证号为SCXK-（军）2012-0004。DMEM/F12（1∶1）基础培养基（美国Gibco公司），B27无血清添加剂、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子（美国Invitrogen公司），山羊抗兔Bcl-2、Bax、Caspase-3、Sox2、Hes1单克隆抗体（美国Cell Signaling Technology公司），山羊抗兔NeuN多克隆抗体、山羊抗小鼠Nestin单克隆抗体、内参抗体山羊抗小鼠β-肌动蛋白单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的兔抗山羊和小鼠抗山羊IgG二抗（美国Abcam公司），超敏ECL化学发光试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物技术研究所），PIPA细胞裂解液（美国Sigma公司）。
Mode-6.3电子可控性皮质撞击仪（美国Custom Design公司），24000B倒置荧光显微镜（德国Leica DMI公司），Multiskan GO酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific公司），FluorChem®HD2化学发光凝胶成像系统（美国ProgeinSimple公司）。
实验大鼠的饲养条件为：自然光照，白昼交替，安静环境，湿度（40±50）%，温度（25±2）℃，自由进食饮水，实验前按无特定病原体级标准适应性饲养1 d后进行实验。取孕14 d的雌性Sprague-Dawley大鼠吸入乙醚麻醉后浸入75%乙醇中消毒；打开腹腔取出胎鼠置于冰盘中，用弯镊逐一暴露并取出胎脑皮层，剔除胎脑表面的软脑膜及血管后置于DMEM/F12（1∶1）基础培养基中；随后用眼科剪将大脑皮层组织剪碎，巴氏吸管反复进行机械吹打后经200目筛网过滤，制备细胞悬液，以上操作均于冰上进行；再用0.25%胰酶消化细胞，吹打制备单细胞悬液，加入完全培养基（含质量浓度为20 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、20 ng/ml表皮生长因子、体积分数为2%神经细胞生长因子B27的DMEM/F12培养基），细胞浓度为2×106/ml，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。3~4 d后行半量换液，5~7 d即可形成NSCs球。待细胞密度达70%~80%时，进行传代。
取第3代NSCs接种于多聚赖氨酸包被的盖玻片上，置于37 ℃、5%CO2培养箱中孵育。次日，行Nestin免疫荧光学染色。详细步骤如下：用质量浓度为40 g/L的甲醛溶度固定30 min；然后用体积分数为0.5%的曲拉通X-100破膜15 min，0.01 mol/L磷酸盐缓冲液洗片3次，每次5 min；接着用质量浓度为50 g/L的牛血清蛋白封闭20 min，加入一抗山羊抗小鼠Nestin单克隆抗体（稀释比例1∶400），4 ℃冰箱内孵育过夜；再加入辣根过氧化物酶标记的小鼠抗山羊IgG二抗，37 ℃温箱避光孵育2 h，0.01 mol/L磷酸盐缓冲液冲洗3次，每次5 min；4'，6-二脒基-2-苯基吲哚染色10 min，0.01 mol/L磷酸盐缓冲液洗片3次，每次5 min；最后用体积分数为50%的缓冲甘油封片，于倒置荧光显微镜下采集图像。
将2.5月龄的Sprague-Dawley雄性大鼠用含体积分数为3%异氟烷的N2O/O2（体积比70∶30）进行麻醉，并用含1.5%异氟烷的N2O/O2维持麻醉状态。将麻醉的大鼠固定于立体定向仪上，剥离骨膜暴露颅骨；以前囟后1.0 mm、中线右侧1.5 mm为中心，开直径约2.5 mm的圆形骨窗，暴露出硬脑膜，注意需保持硬脑膜完整；采用电子可控性皮质撞击仪进行冲击损伤以建立大鼠中重型TBI模型，调整电子可控性皮质撞击仪打击臂与垂直方向角度为20°，设定打击深度为1.5 mm，打击最低点持续时间为200 ms，打击速率为4 m/s。
TBI后3 d取大鼠全脑，切取右侧损伤区及其周围2 mm的脑组织置于冰袋上，并迅速称量湿质量。于无菌条件下将大鼠脑组织剪碎，加入DMEM/F12（1∶1）基础培养基进行匀浆（每150毫克组织加入1 ml培养基）。将匀浆液4 ℃、1 000×g离心10 min，取上清，并经0.2 μm滤器过滤除菌后于低温冰箱中保存备用[8]。
取第3代NSCs，根据加入脑组织提取液的不同，将实验分为3组：对照组、正常脑组织提取液（brain tissue extract，BTE）组和创伤脑组织提取液（traumatic brain injury tissue extract，TBITE）组。对照组为NSCs接种于培养板常规培养；BTE组即将NSCs置于含正常大鼠脑组织提取液的培养基中培养；TBITE组则将NSCs置于含创伤脑组织提取液的培养基中培养。NSCs的接种浓度为5×104/ml，加入的脑组织提取液占培养基体积的20%，24 h后将各组细胞更换正常的新鲜培养基。
取第3代NSCs，胰酶消化后以2×106/ml的细胞浓度接种于细胞培养板中培养，待细胞汇合度达80%时，按1.2.3节方法进行分组；24 h后收集各组细胞蛋白，于12%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶中电泳，每组上样量为20 μg；将蛋白转印于硝酸纤维素膜上，用质量浓度为20 g/L的脱脂奶粉封闭60 min；分别加入一抗山羊抗兔Bax（1∶800）、Bcl-2（1∶1 000）和Caspase-3（1∶600）单克隆抗体，于4 ℃孵育过夜；再加入对应的辣根过氧化物酶标记的二抗室温摇床孵育2 h，滴加ECL发光液于化学发光凝胶成像系统中显影。
将培养的NSCs用胰酶消化后以1×105/ml的细胞浓度接种于96孔板中，按1.2.3节方法进行分组和干预，每组3孔；3 d后每孔加入100 μl噻唑蓝溶液（质量浓度为5 mg/ml），37 ℃孵育4 h；每孔加入三联溶解液（质量浓度为0.1 g/ml的十二烷基硫酸钠，体积分数为5%的异丁醇，0.01 mol/L HCl）温箱孵育12 h，用酶标仪测定各孔于560 nm处的吸光度值，计算细胞增殖率。
取第3代NSCs，接种、分组和干预同1.2.3节；3 d后收集各组细胞，加入RIPA裂解液，离心收集上清，BCA法测蛋白浓度；加入上样缓冲液使蛋白变性，于10%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶中电泳，其余操作同1.2.4节，其中加入的一抗为山羊抗兔Hes1（1∶600）、Sox2（1∶800）单克隆抗体。
取第3代NSCs，胰酶消化后以5×104/ml的细胞浓度接种于细胞培养板中培养，实验分组处理同1.2.3节。7 d后行免疫荧光染色检测NSCs的分化情况（方法同1.2.1节），其中山羊抗兔NeuN多克隆抗体的稀释比例为1∶500。采用倒置荧光显微镜观察、采集图像。随机取10个视野进行拍照计数、取平均值，并计算各组阳性细胞数占细胞总数的百分比，即为近似分化率。
采用SPSS16.0统计学软件处理数据，符合正态分布的计量资料以均值±标准差（
±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
原代NSCs接种时呈单个悬浮圆形细胞，边界清楚，胞质折光性强；培养2 d后，可见部分悬浮生长的细胞球；培养7 d后，细胞球逐渐增大，形成约上百个细胞组成的细胞球（图1A）。NSCs传代后形成单细胞和少量小细胞球组成的细胞悬液。选取第3代NSCs，行NSCs特异性抗原Nestin蛋白免疫荧光染色，镜下可见神经球呈阳性着色，表明神经球内细胞Nestin蛋白高表达，证实其为NSCs（图1B）。
Bax是Bcl-2基因家族中重要的促调亡蛋白，当细胞内Bax增多时，其形成的同源二聚体占主导，则细胞易发生凋亡；当细胞内Bcl-2较多时，凋亡趋势减弱。Bcl-2/Bax比值是决定细胞存亡的关键[9]。TBI后Bcl-2蛋白在存活神经元中的表达量明显增多，提示其为神经系统一种重要的保护性因子。本研究采用Western Blot检测NSCs中Bax及Bcl-2蛋白的表达。结果显示，与BTE组相比，TBITE组Bax蛋白表达升高（F=18.06，P<0.01），而Bcl-2蛋白表达降低（F=22.95，P<0.01），差异均具有统计学意义。（图2）
BTE—正常脑组织提取液；TBITE—创伤脑组织提取液。与BTE组比较，aP<0.01
Caspase-3是调节细胞凋亡的关键蛋白酶。Cleaved caspase-3是Caspase-3活化过程中经剪切产生的活性片段，其表达程度可反映Caspase-3的活性和细胞凋亡情况。为检测脑组织提取液对NSCs调亡的影响，本研究采用Western Blot检测各组NSCs中Caspase-3及Cleaved caspase-3蛋白的表达。结果显示，与BTE组相比，TBITE组Cleaved caspase-3蛋白表达明显升高（F=23.86，P<0.01），差异具有统计学意义。（图3）
BTE—正常脑组织提取液；TBITE—创伤脑组织提取液。与BTE组比较，aP<0.01
噻唑蓝结果显示，与BTE组相比，TBITE组NSCs增殖明显减少（F=41.99，P<0.01），差异具有统计学意义。（图4）
BTE—正常脑组织提取液；TBITE—创伤脑组织提取液。与BTE组比较，aP<0.01
Sox2和Hes1可作为共同的干性基因，调节不同类型干细胞的自我更新，在干细胞增殖时2者均表达上调。Western Blot结果显示，与对照组相比，BTE组Hes1蛋白表达（F=14.05，P<0.01）和Sox2蛋白（F=12.26，P<0.01）表达均升高，其差异均具有统计学意义；而TBITE组Hes1蛋白表达无明显变化（F=14.05，P>0.05），差异无统计学意义，Sox2蛋白表达升高（F=12.26，P<0.01），差异具有统计学意义。（图5）
BTE—正常脑组织提取液；TBITE—创伤脑组织提取液。与对照组比较，aP<0.01
选取第3代NSCs，7 d后行免疫荧光染色检测脑组织提取液对NSCs分化的影响。结果显示，与BTE组相比，TBITE组NSCs的神经元分化率显著下降（F=66.93，P<0.01），差异具有统计学意义。（图6）
BTE—正常脑组织提取液；TBITE—创伤脑组织提取液。与BTE组比较，aP<0.01
中枢神经损伤与修复是目前研究的难点和热点。NSCs的发现为中枢神经系统的损伤修复带来了希望。NSCs是一种能自我更新、自我复制并具有多向分化潜能的细胞，可替代和补充缺失的神经细胞。成体中枢神经损伤后，会诱发内源性神经再生，主要集中于侧脑室壁的室管膜下区和海马齿状回的颗粒下层；但再生的NSCs在损伤区难以存活，从而难以达到理想的治疗效果。因此，NSCs的存活、增殖和定向分化调控是研究的核心问题，但这些问题均受其周围微环境变化的影响[10,11]。干细胞微环境是指对干细胞产生影响的周围结构成分、对干细胞的命运（存活、增殖和分化）起调控作用的三维空间和各种信号分子（生长因子、受体及介导分子）的总称[12,13]。TBI后，损伤部位缺血缺氧、炎性因子和氧自由基的释放以及神经兴奋毒性作用可诱导神经细胞凋亡和坏死[14]，这些均可导致微环境的改变，最终会影响脑组织的宿主细胞或损伤处移植干细胞的命运[15]。大量基础研究与临床试验结果均表明，干细胞移植对于TBI的治疗效果并不理想，其原因主要与干细胞的低存活率相关[16]，究其根本原因主要是局部缺血、缺氧及炎症水肿的化学微环境和TBI后力学物理微环境的改变。本研究主要探讨TBI后化学微环境的变化对NSCs存活、增殖和分化的影响。
TBI可导致氧化应激、炎性反应等，这些均可引起多种促凋亡因子的释放，从而激活下游凋亡相关蛋白Caspase-3，最终导致细胞凋亡[17]。细胞凋亡是一种多基因调控的主动程序化死亡过程，主要由线粒体通路、内质网通路和死亡受体通路组成。目前，大体上将细胞凋亡分为Caspases依赖型和Caspases非依赖型2种。Caspase家族又称半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶，可通过线粒体通路和死亡受体通路调节细胞凋亡。其中，Caspase-3作为调节细胞凋亡的关键蛋白酶，也被称为"死亡蛋白酶" ，是目前已知的凋亡最终执行因子，在缺血再灌注脑损伤及TBI等多种疾病的发生发展过程中发挥着重要作用[18]。
Caspases依赖型和Caspases非依赖型凋亡均由Bcl-2调控。Bcl-2基因家族包括抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax 2大类成员，是TBI后细胞凋亡的重要调控基因。Bcl-2和Bax的平衡在细胞凋亡过程中发挥着极其重要的作用[19]。Bax可促进细胞凋亡，且其基因表达量与细胞凋亡程度成正比，而Bcl-2的过量表达可减少细胞凋亡。因此，可通过干预Bcl-2和Bax的表达达到抑制或促进细胞凋亡的目的。本研究采用TBI大鼠的脑组织提取液来模拟TBI后的化学微环境。通过实验分组来观察不同脑组织提取液对体外NSCs存活的影响。Western Blot检测NSCs凋亡结果显示，正常脑组织提取液可减少NSCs凋亡，而创伤脑组织提取液可增加NSCs凋亡，这也与TBI后化学微环境的改变导致移植NSCs存活率降低相一致。
在胚胎神经系统发育过程中，Hes1蛋白的表达对保持NSCs数量、调控其分化至关重要。Yang等[20]在对成人急性TBI大脑皮质蛋白表达水平变化的研究中发现，脑组织损伤后Hes1蛋白的表达水平明显发生改变，表明Hes1蛋白参与了神经系统发育过程中NSCs的调控。在成年个体内，Hes1蛋白表达上调可激活静止期的纤维母细胞而使其获得分裂增殖的能力。有研究结果显示，Hes1蛋白表达量的升高可激活成体中处于静止期的干细胞，使其在经历数周甚至数年的细胞周期停滞后，仍保留有重新开始增殖的能力[21]，这说明Hesl蛋白在成体细胞中尤其是成体干细胞的增殖中发挥重要作用。本研究中，笔者采用TBI大鼠的脑组织提取液来模拟TBI后的化学微环境，检测了不同脑组织提取液对NSCs增殖的影响。结果发现，与对照组相比，BTE组Hes1蛋白表达明显升高，提示NSCs增殖能力显著提高；而TBITE组Hes1蛋白表达明显降低，提示NSCs增殖能力显著降低。
Sox2是转录因子的一种，其表达发生在整个成年期中枢神经系统的神经发生区域，被认为是NSCs的另外一个标志物。Sox2在干细胞的维持中也起着关键作用，并常被作为一种多能性细胞谱系的分子标记[22]。Sox2基因在成人组织细胞中表达并具有广泛的调节作用，特别是在保持组织稳态性方面具有重要功能。为此，Sox2可作为一个共同的干性基因，调节不同类型干细胞和组织的自我更新。本研究通过Western Blot检测了脑组织提取液对NSCs增殖的影响，结果表明，与对照组相比，BTE组Sox2蛋白表达明显升高，TBITE组Sox2蛋白表达次之，提示NSCs增殖能力显著提高。同样，噻唑蓝实验结果也显示正常脑组织提取液和创伤脑组织提取液均可促进NSCs增殖，但正常脑组织提取液的促进作用更明显。
目前，以各种神经营养因子治疗TBI及其对神经细胞保护性作用的相关研究备受关注，而靶源性神经营养因子是神经发育中诱导轴突生长的关键信号分子。TBI早期，损伤区存活的神经细胞可分泌利于神经修复的细胞因子如神经生长因子、白细胞介素-6、神经营养因子3、脑源性神经生长因子等。其中，神经营养因子3可促进NSCs向神经元分化，白细胞介素可明显促进NSCs分化，且分化细胞中神经元的比例显著增大[23]。脑组织提取液中含有多种神经营养因子，它们可能会促进神经细胞分化并维持其正常功能。Chudickova等[24]分别利用脑组织提取液、成纤维细胞生长因子和表皮细胞生长因子刺激间充质干细胞分化。结果显示，脑组织提取液可明显促进充质干细胞分化为神经元。这为笔者提出的脑组织提取液可能对NSCs分化具有一定影响的假设提供了依据。本研究结果显示，正常脑组织提取液可提高NSCs的神经元分化率，这可能与正常脑组织提取液中神经营养因子的作用有关；而创伤脑组织提取液则可降低NSCs神经元分化率，可考虑与创伤后脑组织提取液中的炎性因子和氧自由基等有害成分导致化学微环境发生改变有关。
NSCs替代疗法是神经创伤修复的理想选择。大脑存在多种神经营养因子及其受体的表达，而这些神经营养因子可促进神经再生，诱导创伤后神经环路的重建。在此基础上，本研究检测了脑组织提取液对体外NSCs存活、增殖与分化的影响，为NSCs疗法向临床应用转化奠定了基础，但具体是脑组织提取液中的哪些有效神经营养因子发挥作用还是其综合性影响尚有待今后进一步探讨。
利益冲突 无
