构建一种新型的巯基化壳聚糖修饰的聚乳酸-聚己内酯-聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯（PLA-PCL-TPGS）纳米粒，探讨其用作肺癌口服化疗药物载体的可行性。
合成PLA-PCL-TPGS无规共聚物并进行表征，再以商业化的PCL和PLA-PCL-TPGS无规共聚物制备3种用于口服递送紫杉醇的纳米载体：5%巯基化壳聚糖修饰的PCL纳米粒（CNP）、未修饰的PLA-PCL-TPGS纳米粒（UNP）和5%巯基化壳聚糖修饰的PLA-PCL-TPGS纳米粒（TNP），并对其粒径、Zeta电位、表面形态、载药量和包封率进行表征，研究其体外药物释放行为、体外人肺癌细胞A549的摄取及对A549细胞的毒性，采用离体肠吸收实验测定跨肠道屏障转运的紫杉醇含量。
成功合成了PLA-PCL-TPGS无规共聚物。场发射扫描电镜结果表明，3种载紫杉醇的纳米粒均呈球状，粒径约200 nm。PLA-PCL-TPGS纳米粒经巯基化壳聚糖修饰后，表面由负电荷转为正电荷。UNP和TNP的载药量、包封率和32 d内的紫杉醇累积释放率均高于CNP，差异均具有统计学意义（均P<0.05）。A549细胞对TNP的摄取率显著高于CNP和UNP，差异均具有统计学意义（均P<0.05）。体外细胞毒性研究结果显示，TNP较临床应用的紫杉醇注射液对A549细胞具有更强的细胞毒性。离体肠吸收实验结果显示，TNP可通过开放紧密连接、绕过P-糖蛋白外排泵增加紫杉醇的运输。
PLA-PCL-TPGS纳米粒经巯基化壳聚糖修饰后能增强细胞摄取和细胞毒性，有望用作肺癌口服化疗药物载体。
版权归中华医学会所有。
未经授权，不得转载、摘编本刊文章，不得使用本刊的版式设计。
除非特别声明，本刊刊出的所有文章不代表中华医学会和本刊编委会的观点。
肺癌是世界最常见的致命癌症之一。口服化疗因其能给癌症患者提供更多便利、减少患者往返医院次数而迅速成为一种颇具吸引力的选择[1]。口服化疗还可使血药浓度维持在适当水平以延长肿瘤细胞暴露于药物的时间，从而增强疗效，减少不良反应。然而，大多数抗肿瘤药物如口服紫杉烷类药物的生物利用度极低[2]。其部分原因是紫杉烷类药物与胃肠道黏膜的P-糖蛋白（P-glycoprotein, P-gp）外排泵具有很高的亲和力，P-gp可能限制了药物的吸收，调节其直接被排泄至肠腔[3]。提高紫杉烷类药物生物利用度的方法尚处于研究中，而聚合物纳米粒可不被P-gp外排泵识别，减少P-gp介导的药物外排，从而减少多药耐药性，有望用于提高口服药物的生物利用度[4]。此外，聚合物纳米粒还可保护包封的药物不在肠管腔降解以及肠壁代谢[5]。
有文献报道，壳聚糖能通过开放上皮细胞间的紧密连接来增强上皮通透性[6]，将巯基共价连接到壳聚糖上能大大增强其黏附性和渗透性而不影响其生物降解性[7,8]。同时，巯基化壳聚糖作为纳米药物载体具有诸多优点，如无毒、生物相容性、生物可降解性，能控制药物、蛋白质和肽的释放[9,10,11]；可溶于水介质中，避免了有机溶剂的使用，且无需进一步纯化纳米粒[12]。因此，巯基化壳聚糖修饰的纳米粒有望成为口服药物的新型载体。
聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯（d-α-tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate, TPGS）是维生素E的水溶性衍生物，能通过抑制P-gp泵提高药物的跨膜渗透性，从而增加药物吸收，减少肿瘤细胞中P-gp介导的多药耐药[13,14]。此外，TPGS还能有效抑制体外人肺腺癌细胞的生长[15]。目前，关于TPGS与其他抗肿瘤药物协同效应的研究很少[16]，且与纳米粒制备过程中常用的乳化剂聚乙烯醇相比，TPGS乳化的纳米粒具有包封率和细胞摄取量高、半衰期长、疗效佳的优点[14]。
本研究中，笔者构建了一种新型可生物降解的聚合物纳米粒——巯基化壳聚糖修饰的聚乳酸-聚己内酯-聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯（poly（lactide-co-ε-caprolactone）-d-α-tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate, PLA-PCL-TPGS）纳米粒，并以紫杉醇为模型药物，探讨该纳米粒用作肺癌口服化疗药物载体的可行性。
丙交酯、TPGS、PCL（相对分子质量为42 ku）、辛酸亚锡、4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）（美国Sigma-Aldrich公司），ε-己内酯（比利时Acros Organics公司），巯基化壳聚糖（相对分子质量为33 ku）（上海升耀生物技术有限公司），紫杉醇（纯度99.9%）（云南汉德生物技术有限公司），紫杉醇注射液（商品名泰素，规格5 ml:30 mg，批号H20110470）（美国Bristol-Myers Squibb公司），胎牛血清（美国Gibco公司），磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline, PBS）（北京索莱宝科技有限公司），0.25%胰酶-EDTA溶液(美国Invitrogen公司），Dako荧光封片剂（丹麦Dako公司），噻唑蓝（thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT）（美国Amresco公司），人结肠癌细胞Caco-2（美国模式培养物集存库）。健康无特定病原体级8周龄雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠9只，体质量为200~240 g，购自中国医学科学院医药生物技术研究所，许可证号：SYXK（京）2012-0021。
Bruker ACF300核磁共振波谱仪（德国Bruker公司），Nano-ZS动态激光粒度分析仪（英国Malvern公司），ZEISS 77 SUPRA 40VP场发射扫描电子显微镜（德国Carl Zeiss公司），LC 1100高效液相色谱（美国Agilent Technologies公司），Tecan GENios Pro多功能酶标仪（瑞士Tecan公司），Olympus Fluoview FV-1000激光扫描共聚焦显微镜（日本Olympus公司），Model 680酶标仪（英国Bio-Rad Laboratories公司）。
PLA-PCL-TPGS无规共聚物是以辛酸亚锡为催化剂，由ε-己内酯、丙交酯和TPGS通过开环聚合而成。将一定质量的ε-己内酯、丙交酯、TPGS和1滴辛酸亚锡加入烧瓶中，加热至145 ℃后反应约16 h，反应在无氧和无水环境下进行。将产物溶于二氯甲烷后在过冷甲醇中沉淀以除去未反应的单体和TPGS，抽滤、真空干燥即得PLA-PCL-TPGS无规共聚物。PLA-PCL-TPGS无规共聚物中的TPGS含量和数均相对分子质量通过核磁共振波谱仪测定。
采用改良的溶剂挥发法制备纳米粒[17]。具体方法如下：称取11 mg紫杉醇和100 mg PLA-PCL-TPGS无规共聚物溶于6 ml二氯甲烷中；然后将有机溶液在温和搅拌条件下迅速加入100 ml质量浓度为0.3 g/L的TPGS溶液中，对混合液以30 W功率超声90 s使其形成油包水型乳状液；后者在室温下蒸发过夜除去二氯甲烷，80 000×g离心15 min收集纳米粒，水洗3次除去乳化剂和未包封的药物；最后将纳米粒重悬于5 ml去离子水中后冻干即得载紫杉醇的PLA-PCL-TPGS纳米粒。此外，用6 mg香豆素-6代替紫杉醇制备载香豆素-6的纳米粒。
按文献[18]的方法制备巯基化壳聚糖修饰的PLA-PCL-TPGS纳米粒。将一定质量的巯基化壳聚糖溶于去离子水中使其质量浓度为0.5 mg/ml；冰浴条件下将纳米粒重悬于巯基化壳聚糖溶液中使其质量浓度为9.5 mg/ml，30 W超声30 s；80 000×g离心15 min收集巯基化壳聚糖修饰的PLA-PCL-TPGS纳米粒。巯基化壳聚糖修饰的PCL纳米粒的制备方法同上。
将冻干的纳米粒用去离子水稀释，采用动态激光粒度分析仪测定纳米粒的粒径、粒径分布及表面电位，每项测定3次。
将纳米粒悬液滴至硅片上，用毛细管吸去上清液，喷铂30 s，再用场发射扫描电子显微镜观察纳米粒的表面形态，检测电压为5.0 kV。
采用高效液相色谱法测定载紫杉醇纳米粒的载药量和包封率[18]。称取5 mg冻干的载紫杉醇纳米粒溶于1 ml二氯甲烷中涡旋振荡，将混合液转入5 ml流动相乙腈-去离子水（体积比为50∶50）中，氮气吹15 min除去二氯甲烷，用于高效液相色谱分析。采用紫外-可见光检测器进行测定，检测波长为227 nm，色谱柱为反相C18色谱柱（4.6 mm × 250 mm），流动相流速为1 ml/min。
精确称取载紫杉醇纳米粒15 mg分散至5 ml释放基质（含质量浓度为1 g/L吐温80的PBS，pH7.4）中。将纳米粒悬液转入透析袋后完全浸没于15 ml释放基质中，于37 ℃、130 r/min条件下避光振荡；分别于特定时间点吸取10 ml样品释放液并立即加入等体积的新鲜释放基质；吸取的释放液用二氯甲烷进行提取后溶于5 ml流动相中，氮气吹15 min以除去二氯甲烷，随后用于高效液相色谱分析，绘制载药纳米粒与时间相关的累积释放曲线。
采用Caco-2细胞模拟口服化疗中的胃肠道屏障。Caco-2细胞用含质量浓度为100 μg/ml链霉素和体积分数为20%胎牛血清的DMEM培养基于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，每3天换液1次；待细胞生长融合至80%时，用0.25%胰酶-EDTA溶液消化后以1.3×104个/孔的密度种于96孔黑板中培养；当细胞生长融合至80%时，加入Hank's平衡盐溶液于37 ℃平衡60 min；吸弃后分别加入培养基配制的不同质量浓度的载香豆素-6纳米粒悬液（100、250、500 μg/ml），于37 ℃、5%CO2条件下共培养2 h，阳性对照组则不含细胞，仅加入相同质量浓度的载香豆素-6纳米粒悬液；吸弃纳米粒悬液，用50 μl冷PBS（pH7.4）洗细胞3次以除去残留的纳米粒；用50 μl含质量浓度为5 g/L曲拉通X-100的0.2 mol/L NaOH溶液裂解细胞，再用多功能酶标仪测定每孔的荧光强度值（激发波长为430 nm，发射波长为485 nm）。纳米粒摄取率为细胞相关的荧光强度值所占阳性对照组荧光强度值的百分数。人肺癌细胞系A549的培养及其对载香豆素-6纳米粒的摄取研究方法同上。
将Caco-2细胞种于腔室盖玻片上，当细胞生长融合至80%时，加入质量浓度为250 μg/ml的载香豆素-6的巯基壳聚糖修饰的PLA-PCL-TPGS纳米粒悬液，于37 ℃共培养2 h，冷PBS洗细胞3次；体积分数为70%的乙醇溶液固定20 min，PBS洗2次；DAPI溶液（质量浓度为1 μg/ml）染细胞核5 min，PBS洗2次；Dako荧光封片剂封片后于激光扫描共聚焦显微镜下观察，选择激发波长为488 nm的绿色通道（香豆素-6）和激发波长为340 nm的蓝色通道（DAPI）来分别观察载香豆素-6纳米粒和细胞核。
将A549细胞计数后按5×103个/孔的密度种于96孔板中，培养过夜；分别加入未载药及载紫杉醇的PLA-PCL-TPGS纳米粒、巯基化壳聚糖修饰的PCL纳米粒、巯基化壳聚糖修饰的PLA-PCL-TPGS纳米粒、紫杉醇注射液（紫杉醇质量浓度为0.025、0.250、2.500、12.500、25.000 μg/ml），孵育24、48、72 h；吸弃悬液，加入含MTT（质量浓度为5 mg/ml）的新鲜DMEM培养基，孵育4 h；吸弃MTT溶液，加入150 μl二甲基亚砜溶解甲瓒晶体，用酶标仪在波长570 nm处测定各孔的吸光度（A）值。未被处理的细胞存活率视为100%并设为对照组；未加入MTT的细胞作为空白，校准分光光度计的A值为0。计算各组样品的半抑制浓度（half maximal inhibitory concen- tration, IC50）。
采用外翻肠囊法测定跨肠道屏障转运的紫杉醇含量[19]。SD大鼠饲养于无特定病原体级屏障系统中，温度为（23±2）℃，相对湿度为（55±5）%，人工光照明暗各12 h，自由饮水，常规饲养。SD大鼠于实验前12 h禁食，自由饮水；予以氯胺酮（50 mg/kg）和氯丙嗪（10 mg/kg）腹腔麻醉，打开腹腔，迅速取出空肠（约5 cm），并用Krebs-Ringer碳酸氢钠溶液（pH7.4）冲洗至无内容物为止；将空肠小心外翻，将自制硅胶套管软端插入空肠一端并用手术线结扎，空肠另一端也用手术线进行结扎；使用注射针通过硅胶套管向肠囊内注入1 ml Krebs-Ringer碳酸氢钠溶液，置于经95%O2和5%CO2饱和的含测试样品的Krebs-Ringer碳酸氢钠溶液中，实验过程中保持37 ℃恒温。测试的样品有紫杉醇注射液和载紫杉醇的巯基化壳聚糖修饰的PLA-PCL-TPGS纳米粒（均含1 mg紫杉醇），在肠吸收实验中，将O2和CO2混合物通入肠黏膜使肠蠕动。在特定时间点，收集0.5 ml肠囊内的溶液并加入等体积的新鲜Krebs-Ringer碳酸氢钠溶液继续实验，采用高效液相色谱法测定收集液中紫杉醇的含量。
采用SPSS10.0统计学软件处理数据，符合正态分布的数据以均值±标准差（
±s）表示，两组间数据比较采用t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。
以CDCl3为溶剂，采用核磁共振仪来表征PLA-PCL-TPGS无规共聚物的结构，图1显示了PLA-PCL-TPGS无规共聚物的化学结构和核磁共振氢谱。化学位移（δ）5.20和1.69处的峰a和峰e分别对应PLA部分的CH和—CH3质子特征峰，3.65处的峰c对应TPGS中PEO的—CH2质子特征峰，脂肪族区核磁信号较低的峰对应维生素E中长链烃上的质子特征峰，4.06（峰b）、2.31（峰d）、1.60~1.70（峰e）和1.35~1.43（峰f）分别对应PCL部分中—OCH2、—COCH2、—CH2（4H）和—CH2（2H）的质子峰。测得PLA-PCL-TPGS无规共聚物的数均相对分子质量为33 229。ε-己内酯、丙交酯、TPGS的投料比（质量比）分别为0.75∶0.15∶0.10，合成的PLA-PCL-TPGS共聚物中3者的质量分数分别为87.18%、8.17%和4.64%。
PLA-PCL-TPGS—聚乳酸-聚己内酯-聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯
制备的载紫杉醇的5%巯基化壳聚糖修饰的PCL纳米粒（5% thiolated chitosan-modified PCL nanoparticles，CNP）、未修饰的PLA-PCL-TPGS纳米粒（unmodified PLA-PCL-TPGS nanoparticles，UNP）和5%巯基化壳聚糖修饰的PLA-PCL-TPGS纳米粒（5% thiolated chitosan-modified PLA-PCL-TPGS nanoparticles，TNP）的粒径数据如表1所示。纳米粒的粒径被认为是有关纳米粒摄取的一个重要参数，小粒径的纳米粒可提供大的比表面积，增加黏液素的吸附，从而导致纳米粒的高黏附特性[20]。纳米粒的肠黏膜渗透性随着纳米粒尺寸的增加（最大增至约500 nm）而降低[21]。其中，平均粒径约为200 nm的纳米粒较有利于肠道摄取[5]。由表1可知，巯基化壳聚糖的加入使纳米粒的粒径略有增加。Zeta电位分析结果证实，5%巯基化壳聚糖的表面改性使PLA-PCL-TPGS纳米粒从表面负电荷（-18.29 mV）逆转为显著正电荷（24.66 mV）。有文献报道，由于黏膜层带负电荷，故正表面电荷的纳米粒可增加黏膜对其的摄取[22]。载紫杉醇TNP的场发射扫描电子显微镜图显示，纳米粒呈球状且表面粗糙，所得纳米粒粒径与动态激光粒度分析仪测得的结果相一致（图2）。
载紫杉醇纳米粒的表征（n=3，
±s）
载紫杉醇纳米粒的表征（n=3，±s）
| 载体类别 | 粒径（nm） | 多分散系数 | Zeta电位（mV） | 载药量（%） | 包封率（%） |
|---|---|---|---|---|---|
| 5%巯基化壳聚糖修饰的PCL纳米粒 | 203.56±4.35 | 0.335 | -19.63±4.10 | 8.69±0.15 | 86.55±1.50 |
| 未修饰的PLA⁃PCL⁃TPGS纳米粒 | 198.46±2.49 | 0.246 | -18.29±3.25 | 9.89±0.25a | 98.79±2.62a |
| 5%巯基化壳聚糖修饰的PLA⁃PCL⁃TPGS纳米粒 | 206.15±3.66 | 0.286 | 24.66±4.19 | 9.79±0.24a | 97.56±2.15a |
注：PCL—聚己内酯；PLA—聚乳酸；TPGS—聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯。与5%巯基化壳聚糖修饰的PCL纳米粒比较，aP<0.05
PLA-PCL-TPGS—聚乳酸-聚己内酯-聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯
3种载紫杉醇纳米粒的载药量和包封率见表1，UNP和TNP的载药量和包封率均比CNP高，差异均具有统计学意义（均P<0.05），这可能与PLA-PCL-TPGS共聚物中TPGS的自乳化有关。
图3载紫杉醇的CNP、UNP和TNP在32 d内的体外药物释放曲线。TNP在5 d和32 d内的药物累积释放率分别为38.47%和66.59%，明显高于CNP同时间段的药物累积释放率（20.10%和38.00%），其差异均具有统计学意义（均P<0.05）。这可能是由于TNP中的PLA-PCL-TPGS共聚物较CNP中的PCL相对分子质量低且疏水性更高，使得共聚物溶胀和降解速度均加快，从而促进了药物的释放。此外，TNP的药物累积释放率稍低于UNP，32 d内的药物累积释放率差异亦具有统计学意义（P<0.05），这可能是由于UNP的粒径较TNP稍小。
CNP—5%巯基化壳聚糖修饰的PCL纳米粒；UNP—未修饰的PLA-PCL-TPGS纳米粒；TNP—5%巯基化壳聚糖修饰的PLA-PCL-TPGS纳米粒；PCL—聚己内酯；PLA—聚乳酸；TPGS—聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯
人结肠癌细胞Caco-2是一个被广泛用于预测化合物在人体内渗透和吸收的细胞模型[23]。紫杉醇注射液能有效治疗转移性肺癌，并可结合其他细胞毒性药物进行联合治疗。而对A549细胞摄取纳米粒的荧光分析为评估各种剂型紫杉醇对肺癌的体外疗效提供了模型[13]。因此，笔者以Caco-2细胞作为体外胃肠屏障模型，A549细胞为肿瘤细胞模型，研究这2种细胞对载香豆素-6 CNP、UNP和TNP的摄取，分析纳米粒与细胞孵育2 h时纳米粒的摄取率。由图4A可知，Caco-2细胞对载香豆素-6 TNP的摄取率较CNP和UNP高。当载香豆素-6 TNP的质量浓度分别为100、250和500 μg/ml时，Caco-2细胞对其的摄取率分别是对同质量浓度载香豆素-6 CNP的1.45、1.61和1.67倍，是载香豆素-6 UNP的1.48、1.72和1.72倍，其差异均具有统计学意义（均P<0.05）。同时还可看出，细胞摄取纳米粒的过程是呈浓度依赖的。图4B显示，A549细胞对载香豆素-6 TNP的摄取率亦较CNP和UNP高，且呈浓度依赖性。载香豆素-6 TNP的摄取率分别是同质量浓度（100、250、500 μg/ml）载香豆素-6 CNP的1.49、1.68和1.93倍，是载香豆素-6 UNP的1.31、1.36和1.65倍，其差异亦均具有统计学意义（均P<0.05）。由于巯基化壳聚糖表面带正电荷，能增强其与带负电荷细胞膜的相互作用，故能更好地辅助药物递送，延长纳米粒在细胞表面的停留时间，进而增加纳米粒的摄取机率，改善口服药物的生物利用度[9]。
CNP—5%巯基化壳聚糖修饰的PCL纳米粒；UNP—未修饰的PLA-PCL-TPGS纳米粒；TNP—5%巯基化壳聚糖修饰的PLA-PCL-TPGS纳米粒；PCL—聚己内酯；PLA—聚乳酸；TPGS—聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯。与TNP比较，aP<0.05；与UNP比较，bP<0.05
将Caco-2细胞与载香豆素-6 TNP悬液（质量浓度为250 μg/ml）孵育2 h后，采用激光扫描共聚焦显微镜进行观察，结果显示，载香豆素-6 TNP（绿色）分布于细胞核（蓝色，DAPI染色）周围的胞质中，表明纳米粒已内化进入细胞。（图5）
PLA-PCL-TPGS—聚乳酸-聚己内酯-聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯
将A549细胞分别与紫杉醇注射液、载紫杉醇的CNP、UNP和TNP（紫杉醇质量浓度分别为0.025、0.250、2.500、10.000、25.000 μg/ml）孵育24、48和72 h，测定细胞的存活率。结果显示，与目前临床使用的剂型紫杉醇注射液相比，载紫杉醇的CNP、UNP和TNP 3种纳米粒剂型均降低了肿瘤细胞的存活率，其中载紫杉醇TNP较UNP细胞毒性更强。A549细胞与紫杉醇注射液（紫杉醇质量浓度为10 μg/ml）孵育24 h后的存活率仅为44.41%，而与同质量浓度的载紫杉醇TNP孵育24 h后的存活率仅为28.65%，其差异具有统计学意义（P<0.05）。与紫杉醇注射液相比，A549细胞与同质量浓度的载紫杉醇TNP孵育48和72 h后的细胞毒性分别增加了37.65%（P<0.05）和18.72%（P<0.05），这可能是由于纳米粒中的巯基化壳聚糖和TPGS增强了细胞对纳米粒的摄取。各剂型对肿瘤细胞毒性大小依次为TNP>UNP>紫杉醇注射液，且呈时间依赖性，这可能与纳米粒的控释特性相关；同时亦呈药物浓度依赖性，药物浓度越高，对肿瘤细胞毒性越大。（图6）
±s，n=6）CNP—5%巯基化壳聚糖修饰的PCL纳米粒；UNP—未修饰的PLA-PCL-TPGS纳米粒；TNP—5%巯基化壳聚糖修饰的PLA-PCL-TPGS纳米粒；PCL—聚己内酯；PLA—聚乳酸；TPGS—聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯。与相同质量浓度和孵育时间的紫杉醇注射液比较，aP<0.05
±s，n=6）将A549细胞分别与紫杉醇注射液、载紫杉醇的CNP、UNP和TNP（紫杉醇质量浓度分别为0.025、0.250、2.500、10.000和25.000 μg/ml）孵育24、48和72 h，再通过剂量-效应曲线来计算4种紫杉醇制剂对A549细胞的IC50值。结果如表2所示，A549细胞与紫杉醇注射液孵育24、48和72 h的IC50值分别为2.609、1.645和0.910 μg/ml，而与载紫杉醇TNP孵育24、48和72 h的IC50值则分别降至0.201、0.122和0.106 μg/ml。随着孵育时间的延长，载紫杉醇TNP较商业化的紫杉醇注射液具有更低的IC50值和更好的体外疗效，这是因为载紫杉醇TNP在24、48和72 h时的紫杉醇累积释放率仅为22.63%、26.52%和32.45%（图3），且是从0开始释放；而商业化的紫杉醇注射液的释放率则是即刻成为100%。此外，PLA-PCL-TPGS无规共聚物可能会释放TPGS，而后者与抗肿瘤药物具有协同抗肿瘤作用[16]，从而增加了肿瘤细胞的死亡率。Hasegawa等[24]报道了壳聚糖对肿瘤细胞生长具有抑制作用。他们还观察到经巯基化壳聚糖处理的肿瘤细胞中出现了DNA片段（这是细胞凋亡的特征）以及caspase-3活性升高，这表明巯基化壳聚糖通过激活肺癌细胞中的caspase-3来诱导细胞凋亡。因此，巯基化壳聚糖可能同样会增加肿瘤细胞的死亡率，且在抗肿瘤药物和TPGS存在的情况下具有协同抗肿瘤作用。
A549细胞与紫杉醇制剂孵育不同时间的IC50（μg/ml）
A549细胞与紫杉醇制剂孵育不同时间的IC50（μg/ml）
| 剂型 | 24 h | 48 h | 72 h |
|---|---|---|---|
| 紫杉醇注射液 | 2.609 | 1.645 | 0.910 |
| 载紫杉醇CNP | 2.035 | 1.748 | 0.692 |
| 载紫杉醇UNP | 0.958 | 0.634 | 0.325 |
| 载紫杉醇TNP | 0.201 | 0.122 | 0.106 |
注：IC50—半数致死浓度；CNP—5%巯基化壳聚糖修饰的PCL纳米粒；UNP—未修饰的PLA-PCL-TPGS纳米粒；TNP—5%巯基化壳聚糖修饰的PLA-PCL-TPGS纳米粒；PCL—聚己内酯；PLA—聚乳酸；TPGS—聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯
本研究采用外翻肠囊法测定跨肠道屏障转运的紫杉醇含量，结果显示，120 min时载紫杉醇TNP和UNP跨肠道屏障转运的紫杉醇含量要显著高于紫杉醇注射液，差异具有统计学意义（P<0.05）。由此可知，跨肠黏膜转运的游离紫杉醇很少，而黏附纳米粒可通过开放紧密连接和绕过P-gp外排泵增加紫杉醇的转运。（图7）
UNP—未修饰的PLA-PCL-TPGS纳米粒；TNP—5%巯基化壳聚糖修饰的PLA-PCL-TPGS纳米粒；PCL—聚己内酯；PLA—聚乳酸；TPGS—聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯
以紫杉醇为模型药物，采用可生物降解的自制PLA-PCL-TPGS无规共聚物和商业化的抗肿瘤药物口服载体材料PCL制备了3种纳米粒（CNP、UNP和TNP）。在纳米粒基体材料设计方面，充分利用了TPGS在纳米粒制备过程中的优势如良好的乳化效果、高包封率、减小P-gp介导的多药耐药性和优越的抗肿瘤效果。巯基化壳聚糖可大大增强纳米粒的黏膜黏附性和渗透性，从而增加纳米粒通过胃肠黏膜被摄取的机率，改善药物的吸收。研究结果表明，TNP的细胞摄取率明显比CNP和UNP高。体外细胞毒性结果表明，载紫杉醇TNP对A549细胞的细胞毒性较商业化的紫杉醇注射液强，推断是由于TNP能通过开放紧密连接和绕过P-gp外排泵增加紫杉醇的转运。总之，利用巯基化壳聚糖修饰的PLA-PCL-TPGS纳米粒制剂进行口服化疗有望成为治疗肺癌的替代方法。
利益冲突 无
