探讨脐带间充质干细胞（UCMSCs）移植对急性心肌缺血-再灌注损伤（AMI-R）大鼠血管内皮生长因子（VEGF）及单核细胞趋化因子-1（MCP-1）的影响。
将24只Sprague-Dawley大鼠按随机数字表法分为假手术组、AMI-R组及AMI-R+干细胞治疗组，每组8只。UCMSCs移植后第10天处死大鼠，取结扎线以下心肌组织，分别采用逆转录PCR和Western Blot检测MCP-1 mRNA及蛋白的相对表达水平，免疫组化染色检测VEGF蛋白的表达。
AMI-R+干细胞治疗组MCP-1 mRNA及蛋白的相对表达水平均明显低于假手术组和AMI-R组，差异均具有统计学意义（均P<0.05），且VEGF蛋白表达明显高于假手术组和AMI-R组，差异均具有统计学意义（均P<0.05）。
UCMSCs移植治疗AMI-R大鼠可有效促进损伤区域的血管重建并抑制炎症反应。
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当前，急性心肌梗死已成为全世界致死率最高的疾病，严重威胁着人类的健康。通过溶栓或介入手段实现血流再灌注是治疗急性心肌梗死的最有效方法，而血流复灌后会出现比单纯缺血更为严重的现象，即缺血-再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury, I-R）[1,2]。无论是溶栓、介入还是普通药物治疗均只是对症治疗，不能从根本上治愈I-R。目前，针对I-R的干预在世界范围内尚缺乏有效对策，治疗效果亦不尽人意。近年来，随着干细胞技术的发展，科研人员及医疗工作者寄希望于采用干细胞技术解决I-R这一医学难题。针对I-R的干细胞治疗已在基础研究及临床试验方面取得了令人鼓舞的效果，本研究旨在探讨利用脐带间充质干细胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSCs）治疗急性心肌缺血-再灌注损伤（acute myocardium ischemia-reperfusion injury，AMI-R）大鼠后对血管重建及炎症反应的影响，以期为AMI-R的治疗提供新思路。
山羊抗大鼠血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）多克隆抗体、山羊抗大鼠单核细胞趋化因子-1（monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1）多克隆抗体、兔抗大鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH）多克隆抗体、生物素化二抗（IgG）、辣根过氧化物酶标记的兔抗山羊和山羊抗兔IgG抗体（美国Sigma-Aldrich公司），干细胞培养基（加拿大STEMCELL公司）。脐带来源于武警后勤学院附属医院，脐带的采集经产妇同意并签署知情同意书。健康无特定病原体级14周龄Sprague-Dawley雄性大鼠24只，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，体质量（225±19）g，许可证号为SCXK（京）2012-0001。
生物安全柜（中国苏净集团安泰公司），Leica DMi8-M倒置荧光显微镜、RM2235石蜡切片机（德国Leica公司），BH2-BHS光学显微镜（日本Olympus公司），Sigma 3-18K台式高速冷冻离心机（德国Sigma公司），Image-Pro Plus多功能真彩色细胞图像分析管理系统（美国Media Cybernetics公司）。
按文献[3]从脐带获取UCMSCs并进行传代培养，取第4~5代UCMSCs用于本研究。
用质量浓度为30 g/L的戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉大鼠（1 ml/kg），背位固定于动物手术台上；将大鼠胸部去毛，消毒；从胸部正中切口，开胸，剪断第5和第6根肋骨，并以止血钳扩张切口，顺势借助心脏搏动的力量将心脏挤出胸腔，随后立即将缝合线穿至冠状动脉前降支以下，结扎阻断血流，注意该过程动作要迅速、轻柔，于1 min内完成；30 min后剪断结扎线，恢复血流灌注。心电图的ST段抬高视为模型制作成功。
实验大鼠于动物室内分笼喂养，室内温度为（20±3）℃，湿度为（50±20）%，每天光照12 h，并提供全营养鼠粮及足量清洁饮水。将实验大鼠按随机数字表法分为3组：假手术组、AMI-R组及AMI-R+干细胞治疗组，每组8只。假手术组只开胸，冠状动脉前降支下穿线不结扎；AMI-R组及AMI-R+干细胞治疗组大鼠按1.2.2节方法构建AMI-R模型后，分别尾静脉注射100 μl生理盐水和等体积的UCMSCs悬液（细胞总数为2×106）。UCMSCs移植后第10天处死动物，取结扎线以下心肌组织备用。
采用Trizol法提取结扎线以下心肌组织中的总RNA，逆转录合成cDNA。将cDNA进行PCR，并以β-肌动蛋白为内参基因。PCR反应条件为：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性25 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30个循环，72 ℃再延伸10 min。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，用Image-Pro Plus软件分析各条带灰度值。
取各组大鼠结扎线以下心肌组织100 mg，加入1 ml细胞裂解液与蛋白磷酸酶的混合物（体积比99∶1）进行混合，随后立即加入液氮研磨至碎末，4 ℃、14 200×g离心20 min，取上清并加入蛋白上样缓冲液迅速混匀，沸水中热浴5 min，迅速转移至冰上冷却，再于-20 ℃保存。将保存的各组蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，而后采用湿转法将蛋白转印至聚偏二氟乙烯膜上；以质量浓度为50 g/L的脱脂牛奶封闭60 min；分别加入山羊抗大鼠MCP-1多克隆抗体和兔抗大鼠GAPDH多克隆抗体，4 ℃冰箱过夜；用三羟甲基氨基甲烷缓冲液进行冲洗，加入对应的辣根过氧化物酶标记的兔抗山羊和山羊抗兔IgG抗体（1∶1 2000），室温振荡孵育2 h，于暗室内X光片曝光显影，扫描底片，用Image-Pro Plus软件分析各条带灰度值。
参照文献[3]对各组大鼠结扎线以下心肌组织进行免疫组化染色，检测VEGF蛋白的表达。
采用SPSS13.0统计学软件处理数据，符合正态分布的数据以均值±标准差（
±s）表示，两组间比较采用t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。
逆转录PCR结果显示，假手术组、AMI-R组和AMI-R+干细胞治疗组大鼠结扎线以下心肌组织中MCP-1 mRNA的相对表达水平分别为0.657±0.102、0.768±0.201和0.468±0.09。与假手术组相比，AMI-R组MCP-1 mRNA的相对表达水平明显升高，差异具有统计学意义（P<0.05），而AMI-R+干细胞治疗组有所降低，差异具有统计学意义（P<0.05）。与AMI-R组相比，AMI-R+干细胞治疗组MCP-1 mRNA的相对表达水平明显降低，差异具有统计学意义（P<0.05）。（图1）
1—急性心肌缺血-再灌注损伤组；2—假手术组；3—急性心肌缺血-再灌注损伤+干细胞治疗组；4—β-肌动蛋白
Western Blot结果显示，假手术组、AMI-R组和AMI-R+干细胞治疗组大鼠结扎线以下心肌组织中MCP-1蛋白的相对表达水平分别为0.505±0.190、0.668±0.101和0.368±0.129。与假手术组相比，AMI-R组MCP-1蛋白的相对表达水平明显升高，差异具有统计学意义（P<0.05），而AMI-R+干细胞治疗组有所降低，差异具有统计学意义（P<0.05）。与AMI-R组相比，AMI-R+干细胞治疗组MCP-1蛋白的相对表达水平明显降低，差异具有统计学意义（P<0.05）。（图2）
1—急性心肌缺血-再灌注损伤组；2—假手术组；3—急性心肌缺血-再灌注损伤+干细胞治疗组；MCP-1—单核细胞趋化因子-1；GAPDH—甘油醛-3-磷酸脱氢酶
免疫组化染色结果显示，与假手术组相比，AMI-R组及AMI-R+干细胞治疗组大鼠结扎线以下心肌组织中VEGF蛋白的表达均明显上调，差异均具有统计学意义（均P<0.05）；与AMI-R组比较，AMI-R+干细胞治疗组VEGF蛋白的表达亦明显升高，差异具有统计学意义（P<0.05）。（图3）
AMI-R—急性心肌缺血-再灌注损伤
21世纪以来，心血管疾病因其高发病率和致死率已成为世界范围内的头号杀手。急性心肌梗死作为心血管疾病中最为严重的急症，其处理措施是迅速恢复血流灌注。然而，无论是通过溶栓还是介入手段恢复血流灌注后均会出现I-R。目前，临床上治疗心血管疾病及I-R多为对症治疗，难以达到治本的目的，如对于急性心肌梗死患者多以恢复血流再灌注，然而血流复灌后导致的再灌注损伤、恶性心律失常等将使治疗效果大打折扣，也使原本脆弱的心肌再次承受打击。因此，寻找一种新的行之有效的治本方法是当前医疗界的一大难题[4,5]。
间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一类来源于中胚层或神经外胚层的成体干细胞,广泛存在于多种成体器官和结缔组织中，如骨髓、脂肪、羊水、骨骼肌、脐血和脐带[6]。体外培养的MSCs形态似纤维母细胞，呈贴壁生长。在特定的诱导条件下，MSCs可分化为中胚层来源的成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等，还可诱导分化为肝脏细胞、心肌细胞和神经细胞等。体外培养的MSCs可分泌多种细胞因子，如肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子、纤维母细胞生长因子，低氧诱导因子、VEGF、血管生成素、MCP和白细胞介素等，以起到维持机体稳态、抗炎及免疫调节的作用，稳定机体内环境[7,8]。其中，MCP-1又称单核细胞趋化和激活因子（MCAF），具有趋化和激活单核细胞的双重功能，在炎症的发生发展过程中具有重要作用[9,10,11]。由于MSCs来源广泛且易于分离培养，又具有免疫豁免特性及免疫抑制能力，为其异体移植提供了可能[6,7,8,12]，现已迅速成为干细胞研究领域的热点,被广泛应用于干细胞治疗的基础研究。
目前，干细胞治疗已成为继药物和手术治疗以后的第3次医学革命，其在很多领域取得了令人鼓舞的效果。笔者在AMI-R大鼠模型上行UCMSCs移植术后发现，UCMSCs可向因I-R而受损的心肌组织附近迁移和归巢，结扎线以下的心肌组织中VEGF蛋白表达明显上调，而VEGF蛋白的高表达有利于受损心肌组织血液供应的重建和损伤的耐受。同时笔者发现，予以UCMSCs移植后，炎性因子之一的MCP-1表达明显下调，说明UCMSCs可直接或间接参与炎症反应的调节，对急性期炎症反应起到有效的抑制作用。
综上所述，对AMI-R大鼠模型行UCMSCs移植可有效下调MCP-1的表达并上调VEGF的表达，说明在该模型上干细胞可有效抑制炎症反应，同时又可维持血管内皮功能稳定和促进血管再生。
利益冲突 无
