研究癌间质微环境中癌相关成纤维细胞（CAFs）来源的CCL7对三阴性乳腺癌（TNBC）细胞增殖与侵袭的作用。
采用实时定量PCR和Western Blot分别测定TNBC的CAFs与癌旁成纤维细胞中趋化因子配体7（CCL7）的mRNA及蛋白相对表达水平；采用酶联免疫吸附实验（ELISA）定量检测CAFs与癌旁成纤维细胞条件培养基中的CCL7水平，确定两种细胞的CCL7旁分泌水平；采用MTS和Transwell侵袭实验分别检测CCL7对TNBC细胞株MDA-MB-231增殖和侵袭的影响。
与癌旁成纤维细胞相比，CAFs中CCL7的mRNA及蛋白相对表达水平均明显升高，差异均具有统计学意义（均P<0.01），且CAFs的CCL7旁分泌水平也明显升高，差异具有统计学意义（P<0.01）。MTS和Transwell侵袭实验结果显示，CCL7治疗组MDA-MB-231细胞的增殖率和侵袭能力均明显高于未治疗组，差异均具有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。
TNBC间质微环境中的CAFs可分泌更多的趋化因子CCL7，且CCL7可促进TNBC细胞的增殖和侵袭。
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三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer, TNBC）的进展不仅依赖于癌细胞本身，还需要复杂的间质微环境，而癌相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts, CAFs）是最主要的组成部分之一[1,2]。趋化因子配体7（chemokine（C-C motif）ligand 7, CCL7）作为趋化因子家族的一员，在前列腺癌[3]、口腔癌[4]、胃癌[4]、结肠癌[5]、肾细胞癌[6]的进展中均扮演着重要角色。乳腺癌相关的初步研究结果显示，CCL7对乳腺癌细胞增殖[7]和脑转移过程中乳腺癌起始细胞的自我更新[8]具有一定的促进作用，但对CCL7在TNBC进展中的具体作用研究还存在较多空白。笔者旨在研究CAFs来源的CCL7在TNBC进展中的功能与相关机制。
TNBC细胞株MDA-MB-231（美国模式培养物集存库），DMEM培养基、青链霉素混合液（美国Gibco公司），胎牛血清（美国HyClone公司），小鼠抗人CCL7单克隆抗体、结晶紫染色液（美国Sigma-Aldrich公司），小鼠抗人甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GADPH）单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG（H+L）二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司），CCL7重组蛋白（北京义翘神州公司），Trizol、Oligo（dT）和莫洛尼鼠白血病病毒（MMLV）逆转录酶（美国Invitrogen公司），Transwell小室（美国Corning公司），RIPA蛋白裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物技术研究所），CCL7酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）试剂盒（美国R&D公司），CellTiter 96 AQueous One Solution细胞增殖检测试剂盒（美国Promega公司）。人TNBC组织标本来源于天津医科大学肿瘤医院，本研究获得天津医科大学肿瘤医院伦理委员会批准，所有涉及患者均签署知情同意书。
BX51正置荧光显微镜（日本Olympus公司），iMark酶标仪（美国Bio-Rad公司），5415D离心机（德国Eppendorf公司），FluorChem M Fm0488荧光化学成像仪（美国ProteinSimple公司），ABI 7500 Fast快速实时荧光定量PCR仪（美国Applied Biosystems公司），Nanodrop 2000超微量分光光度计（美国Thermo公司）。
获取人TNBC组织标本的癌组织和癌旁组织，用I型胶原酶和透明质酸酶进行消化，经差速贴壁分离获得乳腺癌CAFs和癌旁成纤维细胞。上述两种细胞及TNBC细胞株MDA-MB-231均用含体积分数为10%胎牛血清、1%青链霉素混合液的DMEM培养基，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。
收集两组成纤维细胞，离心、悬浮于裂解液中，并置冰上裂解1 h，离心10 min后取上清液。采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定上清液中的蛋白浓度，并调整蛋白至相同浓度。取等量样品进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳后转膜，封闭液封闭1 h，分别加入小鼠抗人CCL7和GADPH单克隆抗体，4 ℃孵育过夜；三羟甲基氨基甲烷吐温缓冲液洗3次，每次5 min；加入相应的辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG（H+L）二抗，室温孵育1 h，三羟甲基氨基甲烷吐温缓冲液洗3次，每次5 min；加入发光液，于荧光化学成像仪中显影。
收集成纤维细胞，加入适量Trizol提取总RNA，焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶解后采用分光光度计分别测定其于260 nm和280 nm处的吸光度（A）值。当A260/A280>1.8时，进行后续实验操作。取1 μg RNA作为模板，逆转录得到cDNA，再采用SYBR Green方法，将cDNA、引物、脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）、SYBR Green Mix混合配制反应体系进行PCR。PCR各引物序列如下[7]：CCL7上游引物为5'-ATGAAAGCCTCTGCAGCACT-3'，下游引物为5'-GGACAGTGGCTACTGGTGGT-3'，产物长度为179 bp；GAPDH上游引物为5'-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3'，下游引物为5'-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3'，产物长度为238 bp。
PCR反应条件为95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，40个循环；72 ℃ 5 min。以GAPDH为内参基因，采用2-ΔΔCT法进行相对定量分析。
待体外传代培养的CAFs和癌旁成纤维细胞融合度为80%~90%时，更换为无血清培养基，48 h后分别收集两种细胞的培养上清液作为条件培养基，100×g离心5 min，采用CCL7 ELISA试剂盒检测培养上清液中的CCL7浓度。
将MDA-MB-231细胞以5×103个/孔的密度接种于96孔板中，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养；次日，CCL7治疗组更换为含有质量浓度为50 ng/ml CCL7的DMEM完全培养基，处理24 h，未治疗组更换为新鲜完全培养基处理24 h；弃去培养基，均更换为新鲜完全培养基继续培养48 h；每孔加入20 μl CellTiter 96 AQueous One Solution，37 ℃、5%CO2培养箱中培养4 h；然后用酶标仪检测各组于490 nm处的A值，计算细胞增殖率。
将MDA-MB-231细胞以5×103个/孔的密度接种于预包被基质胶的Transwell小室的上室中，CCL7治疗组Transwell小室的下室中加入含质量浓度为50 ng/ml CCL7、体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基，未治疗组Transwell小室的下室中加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基，放入37 ℃、5%CO2培养箱中培养48 h；弃去上室中的培养基，磷酸盐缓冲液洗上、下室2次，每次5 min；弃去磷酸盐缓冲液，棉签轻轻擦去上室的细胞；下室加入800 μl甲醇固定10 min，弃去甲醇；质量浓度为1 g/L的结晶紫染液染色10 min，流水缓慢洗去染液；切下小室的膜，铺展于载玻片上，采用显微镜进行观察。
采用SPSS17.0统计学软件处理数据，符合正态分布的数据以均值±标准差（
±s）表示，两组间比较采用t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。
实时定量PCR结果显示，与癌旁成纤维细胞相比，CAFs中CCL7的mRNA相对表达水平明显升高（4.16±0.59比1.00±0.11），差异具有统计学意义（P<0.01）（图1）。Western Blot结果显示，CAFs中CCL7的蛋白相对表达水平亦明显高于癌旁成纤维细胞（2.48±0.34比1.00±0.09），差异具有统计学意义（P<0.01）。（图2）
1—癌旁成纤维细胞；2—癌相关成纤维细胞。与癌旁成纤维细胞比较，aP<0.01
1—癌旁成纤维细胞；2—癌相关成纤维细胞；CCL7—趋化因子配体7；GAPDH—甘油醛-3-磷酸脱氢酶。与癌旁成纤维细胞比较，aP<0.01
趋化因子通常需要被旁分泌至细胞外来发挥其生理或病理作用，故本研究采用ELISA法分别检测癌旁成纤维细胞和CAFs的条件培养基中CCL7的蛋白浓度。结果显示，CAFs条件培养基中的CCL7蛋白质量浓度（（75.70±10.21）pg/ml）明显高于癌旁成纤维细胞（（23.60±3.57）pg/ml），差异具有统计学意义（P<0.01），说明TNBC中CAFs的CCL7旁分泌水平明显高于癌旁成纤维细胞。（图3）
1—癌旁成纤维细胞；2—癌相关成纤维细胞。与癌旁成纤维细胞比较，aP<0.01
MTS实验结果显示，与未治疗组相比，CCL7治疗组MDA-MB-231细胞的增殖率明显升高（1.56±0.33比1.00±0.09），差异具有统计学意义（P<0.05）。（图4）
CCL7-趋化因子配体7。与未治疗组比较，aP<0.05
Transwell侵袭实验结果表明，与未治疗组相比，CCL7治疗组的MDA-MB-231细胞侵袭能力明显增强（211.00±21.50比83.30±9.01），差异具有统计学意义（P<0.01）。（图5）
乳腺癌是一种高度异质性疾病，可根据激素受体和人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）的表达水平进行病理亚型分类。其中TNBC缺乏雌激素受体、孕激素受体和HER2的表达，约占所有乳腺癌的15%。与其他亚型的乳腺癌相比，TNBC组织分化更差、侵袭性更高、易于局部复发和远处转移，且无法采用内分泌治疗或HER2靶向抑制剂治疗，故治疗效果及预后较差[9]。由于癌症进展不仅取决于癌细胞本身，还需要复杂的癌间质微环境，而CAFs是最主要的组成部分之一。癌细胞和CAFs通过多种旁分泌细胞信号相互作用，癌细胞可分泌转化生长因子-β、白细胞介素-6、血小板衍生生长因子-α/β、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）等激活CAFs，而CAFs可分泌肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子、基质细胞衍生因子-1等促进癌细胞的生长、侵袭和迁移[2,10]。乳腺癌间质中约80%的成纤维细胞是激活状态的CAFs，其主要位于乳腺癌侵袭前缘，通过旁分泌细胞因子、趋化因子和基质蛋白酶等直接或间接调控乳腺癌的进展。癌旁成纤维细胞与CAFs在形态学、免疫表型、增殖速度、细胞因子释放和细胞外基质沉积等方面均存在差异[11]。进一步研究结果显示，乳腺癌中的CAFs与癌旁成纤维细胞具有不同的基因表达谱[12]，且乳腺癌癌细胞实质与间质的比例与肿瘤复发、远处转移和死亡率亦具有一定的相关性，以TNBC尤为明显[13]。因此，从CAFs角度深入研究调控TNBC进展的分子机制具有重要的基础研究意义与临床应用价值。本研究中，实时定量PCR和Western Blot实验结果显示，TNBC的CAFs的CCL7 mRNA和蛋白相对表达水平均明显高于癌旁成纤维细胞；ELISA实验结果也表明CAFs旁分泌的CCL7蛋白水平明显高于癌旁成纤维细胞，这说明TNBC的CAFs可转录、表达和分泌更高水平的CCL7，这与Rajaram等[7]的研究结果基本相符。笔者由此推断CCL7或许作为CAFs与TNBC细胞间的细胞通讯信号分子而发挥促进TNBC进展的作用。
笔者进一步采用外源性CCL7作用于MDA-MB-231细胞，来探讨CCL7对其增殖和侵袭的作用。研究结果发现，CCL7治疗组MDA-MB-231的细胞增殖率明显高于未治疗组，且细胞侵袭能力亦明显高于未治疗组，表明间质微环境中的CCL7确实可通过促进TNBC细胞的增殖和侵袭而促进其进展，同时也提示CAFs可通过旁分泌CCL7这条信号途径来促进TNBC的进展，有望为后续进一步探索以间质微环境中CCL7为靶点的癌症治疗或干预提供思路。
综上所述，TNBC细胞可旁分泌趋化因子CCL7，后者可促进TNBC细胞的增殖和侵袭，从而促进TNBC的恶性进展。但其具体的更下游的分子作用机制及是否还有其他CAFs来源的信号通路在促进TNBC进展中发挥重要作用，尚需更深入全面的研究。
利益冲突 无
