评估赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶1（LSD1）过表达质粒和LSD1去甲基化片段缺失质粒在人胚肾细胞HEK293T中的表达水平。
采用PCR扩增LSD1片段，重叠PCR扩增LSD1去甲基化作用缺失片段，构建大鼠特异性LSD1过表达质粒和LSD1去甲基化片段缺失质粒，并经琼脂糖凝胶电泳和测序进行验证。将验证后的两种重组质粒与空白载体分别进行包病毒，感染HEK293T后用嘌呤霉素筛选稳定表达的细胞，再用Western Blot和实时定量PCR检测稳定表达的HEK293T细胞内LSD1的表达情况。
琼脂糖凝胶电泳和测序结果表明，LSD1过表达质粒和LSD1去甲基化片段缺失质粒构建成功。Western Blot和实时定量PCR检测结果显示，与空白对照组相比，LSD1过表达组和LSD1去甲基化片段缺失组HEK293T细胞中LSD1蛋白及mRNA的相对表达量均上调，差异均具有统计学意义（均P<0.01）。
构建的LSD1过表达质粒和LSD1去甲基化片段缺失质粒在HEK293T细胞中实现了LSD1基因的过表达，为进一步研究LSD1基因与相关疾病的关系以及LSD1去甲基化作用奠定了基础。
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基因的表达调控是了解肿瘤发生机制的关键问题之一。随着研究的不断深入，科学家们发现基因的表达不仅取决于基因本身，还取决于不改变基因序列的表观遗传修饰。基因的核苷酸序列不发生改变而基因表达发生遗传性变化的学科称之为表观遗传学。表观遗传主要通过DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑等调控基因表达，是一个动态的可逆过程。研究结果表明，DNA和组蛋白在干细胞生长、分化和肿瘤起源等方面发挥重要作用。反之，异常的表观遗传调控常与各种疾病包括肿瘤相关。目前，多种针对DNA和蛋白的甲基化、乙酰化等导致基因表达发生差错的药物已被批准用于癌症治疗。其中组蛋白修饰备受关注，逐渐成为肿瘤表观遗传学的研究重点[1,2]。
甲基化是基因组DNA的一种主要表观遗传修饰形式，是调节基因组功能的重要手段。赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶1（lysine specific demethylase 1，LSD1）是第一个被发现的组蛋白特异性去甲基化酶。在真核细胞中，DNA以染色体形式存在，而核小体是染色体的基本组成单位，由147 bp DNA缠绕在以组蛋白H2A、H2B、H3和H4各两个分子为中心的八聚体上，每个核心组蛋白由一个折叠区和一个氨基末端结构域形成，其显著特征是易被甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化等共价修饰。LSD1能特异性催化一甲基化和二甲基化的组蛋白H3第4位赖氨酸（H3K4me1/2）和第9位赖氨酸（H3K9me1/2）去甲基修饰[3]。
LSD1在肿瘤的发生、增殖、侵袭、转移和复发过程中具有重要作用[4]。多种肿瘤的发生存在LSD1过表达，如乳腺癌[5,6]、前列腺癌[7,8,9]、肺癌[10,11,12]及肝癌[13]。乳腺癌转移的发生是患者死亡的重要原因，而LSD1很可能是影响乳腺癌转移的重要因素。雄激素受体与前列腺癌的发生、发展密切相关，LSD1作为辅助激活子可与雄激素受体相互作用并调节其基因表达调控作用[14,15,16]。此外，LSD1对肺癌细胞的生长、浸润和转移起着关键作用[10,11,12]。因此，抑制LSD1过表达成为控制肺癌的有效方法。Lu等[13]成功揭示了LSD1与肝癌的关系，提示LSD1为肿瘤促进因子，可作为肝癌诊断及治疗的新靶点。
LSD1的表观遗传学改变在肿瘤发生、发展中扮演着重要角色。LSD1表达改变往往伴随着肿瘤的发生，提示LSD1在促进肿瘤的发生、发展过程中极为重要。尽管其中涉及的机制尚未阐明，但LSD1可作为肿瘤治疗的有效靶点。本研究旨在构建LSD1过表达和特异性去甲基化片段缺失质粒，为进一步研究和阐明LSD1与肿瘤发生的关系奠定基础。
2×Trans Taq HiFi PCR SuperMix II、高保真PCR扩增试剂（北京全式金生物技术有限公司），pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro载体质粒（苏州金唯智生物科技有限公司），人胚肾细胞HEK293T（美国模式培养物集存库），RevertAidTM RT Reverse Transcription Kit反转录试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific公司）、QIAquick® Gel Extraction Kit胶回收试剂盒（德国Qiagen公司），Express Plasmid Midiprep Kit质粒中提试剂盒（美国Biomiga公司），T4 DNA连接酶、DH5α感受态细胞、限制性内切酶BamHⅠ、NotⅠ（宝生物工程（大连）有限公司），兔抗人LSD1、H3、H3K4me1、H3K4me2、H3K9me1、H3K9me2单克隆抗体以及小鼠抗人β-肌动蛋白单克隆抗体（英国Abcam公司），辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG、羊抗小鼠IgG二抗（美国Cell Signaling Technology公司），SYBR®Green Master Mix实时定量PCR试剂盒（瑞士Roche公司），ECL化学发光液（美国Millipore公司）。
Tanon 1600全自动化学发光图像分析仪（上海天能科技有限公司），B-48DA博日Gene Touch Plus双模块双梯度PCR仪（杭州博日科技有限公司）。
收集HEK293T细胞，加入500 μl TRIzol剧烈振荡混匀，室温放置5 min；加入200 μl氯仿，剧烈振荡15 s，室温静置2~3 min；4 ℃、12 000×g离心15 min，吸取400 μl上层水相至新离心管中，加入等体积异丙醇颠倒混匀后室温放置10 min；4 ℃、12 000×g离心10 min，弃上清，加入等体积体积分数为75%的乙醇溶液，涡旋充分洗涤；4 ℃、7 500×g离心5 min，弃上清，室温放置空气干燥5~10 min；加入40 μl无RNase水溶解RNA。将RNA反转录为cDNA后以其为模板进行重叠PCR。
分别用LSD1正向引物1和反向引物1及LSD1正向引物2和反向引物2配对进行PCR（引物序列见表1）。PCR条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、60 ℃30 s、72 ℃ 1.5 min，30个循环；72 ℃ 10 min。回收PCR产物，互为模板，再以LSD1正向引物1和反向引物2为引物，加入脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）及Taq酶进行PCR。PCR条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、50 ℃ 30 s、72 ℃ 1.5 min，5个循环；94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 1.5 min，30个循环；72 ℃ 10 min。
LSD1基因引物序列
LSD1基因引物序列
| 引物名称 | 引物序列（5'→3'） |
|---|---|
| 正向引物1 | CGGGATCCATGTTATCTGGGAAGAAGG |
| 反向引物1 | GCGTATACATGGCCCCCAAAAATCCTGTCTTTTTAGTTGGTA |
| 正向引物2 | ACCAACTAAAAAGACAGGATTTTTGGGGGCCATGTATACGCT |
| 反向引物2 | TTGCGGCCGCTCACATGCTTGGGGACTGCTGTGCA |
注：LSD1—赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶1
引物序列：正向引物5'-CGGGATCCATGTTATCTGGGAAGAAGG-3'，反向引物5'-TTGCGGCCGCTCACATGCTTGGGGACTGCTGTGCA-3'。PCR条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 1.5 min，30个循环；72 ℃ 10 min。
PCR产物双酶切（NotⅠ和BamHⅠ）体系：NotⅠ 1 μl，BamHⅠ1 μl，10×酶切缓冲液1 μl，0.1×牛血清白蛋白2 μl，PCR DNA 1 μg，补充双蒸水至20 μl，反应条件为37 ℃ 1.5 h。载体双酶切体系：NotⅠ1 μl，BamHⅠ1 μl，10×酶切缓冲液1 μl，0.1×牛血清白蛋白2 μl，载体DNA（图1）1 μl，补充双蒸水至20 μl，反应条件为37 ℃ 1.5 h。PCR产物和载体酶切产物分别经琼脂糖凝胶电泳进行胶回收，再用QIAquick®Gel Extraction Kit胶回收试剂盒纯化回收DNA片段。
LSD1—赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶1；Region—LSD1基因去甲基化作用位置
取T4 DNA连接酶1 μl、10×T4 DNA连接酶缓冲液2 μl、胶回收的PCR酶切产物0.6 μg及载体酶切产物0.2 μg，补充双蒸水至20 μl，16 ℃反应过夜进行连接。将连接产物转化至DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆于LB培养基中，送菌液进行测序。将测序无误的大肠杆菌于LB培养基中扩大培养，质粒中提。
HEK293T细胞用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM高糖培养基，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。将空白载体质粒pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro、LSD1去甲基化片段缺失质粒和LSD1过表达质粒分别转染HEK293T细胞进行包病毒，得到对应的病毒液。将HEK293T细胞以适宜密度接种至6孔板中，培养至细胞融合度约为80%时，分别使用上述3种病毒液进行感染，对应的组分别为空白对照组、LSD1去甲基化片段缺失组和LSD1过表达组。感染12 h后更换为含体积分数为10%胎牛血清的DMEM高糖培养基，培养12 h；再次用病毒液感染细胞，12 h后收集细胞；嘌呤霉素药筛1周，更换为含体积分数为10%胎牛血清的DMEM高糖培养基进行培养，当细胞融合度约为90%时，收集细胞。
收集HEK293T细胞悬液，1 000×g离心5 min；弃上清，加入磷酸盐缓冲液清洗，1 000×g离心5 min；弃上清，加入细胞裂解液，置于冰上0.5 h，其间每10分钟涡旋1次；0.5 h后4 ℃、12 000×g离心20 min；转移上清至新的1.5 ml离心管中，测定蛋白浓度。向蛋白液中加入4 ×上样缓冲液混匀，100 ℃煮沸10 min；配置10%聚丙烯酰胺凝胶，取20 μg上样，用1 ×上样缓冲液补齐上样量，80 V电压跑至DNA Marker分开后调电压为120 V，待目的条带完全跑开后进行转膜（400 mA、1.5 h）；用含质量浓度为50 g/L牛血清白蛋白的三羟甲基氨基甲烷吐温缓冲液封闭1 h；分别加入兔抗人LSD1、H3K4me1、H3K4me2、H3K9me1、H3K9me2单克隆抗体（均1∶1 000）、兔抗人H3单克隆抗体（1∶5 000）、小鼠抗人β-肌动蛋白单克隆抗体（1∶3 000），4 ℃孵育过夜，三羟甲基氨基甲烷吐温缓冲液洗3次，每次10 min；加入对应的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG和羊抗小鼠IgG二抗（1∶3 000），室温孵育1 h，三羟甲基氨基甲烷吐温缓冲液洗3次，每次10 min；ECL化学发光液显色，全自动化学发光图像分析仪进行成像，Image J软件对条带进行灰度分析。
收集各组细胞，按1.2.1节提取细胞中的总RNA。取1 μg RNA反转录为cDNA，再以cDNA为模板进行实时定量PCR。引物序列：正向引物5'-AGCCAATCCCCCAAGTGATG-3'；反向引物5'-AGGTGGCTGCCAGTAAACTC-3'。反应体系：2×Trans Taq HiFi PCR SuperMixⅡ10 μl，正向引物0.4 μl，反向引物0.4 μl，反应模板2 μl，双蒸水7.2 μl。反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s。
采用SPSS10.0统计学软件处理数据，符合正态分布的计量资料采用均值±标准差（
±s）表示，组间比较采用方差分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。
琼脂糖凝胶电泳结果显示，LSD1去甲基化片段缺失质粒经NotⅠ和BamHⅠ双酶切后得到两条条带，分别位于1 000 bp和8 000 bp（图2A）；LSD1过表达质粒经NotⅠ和BamHⅠ双酶切后得到的两条条带位于3 000 bp和8 000 bp（图2B），均与预期相符。测序结果显示，LSD1去甲基化片段缺失质粒和LSD1过表达质粒的测序序列均与目的序列完全匹配，无间隙或突变，测序结果与预期相符（图3）。
1—DNA Marker；2—经NotⅠ和BamHⅠ双酶切；3—经NotⅠ单酶切；LSD1—赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶1
LSD1—赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶1
Western Blot结果显示：与空白对照组相比，LSD1去甲基化片段缺失组HEK293T细胞中LSD1蛋白的相对表达量上调，差异具有统计学意义（P<0.01），下游蛋白H3K4me1、H3K4me2、H3K9me1、H3K9me2的相对表达量无明显变化，差异均无统计学意义（均P>0.05）；LSD1过表达组LSD1蛋白的相对表达量上调，差异具有统计学意义（P<0.01），下游蛋白H3K4me1、H3K4me2、H3K9me1、H3K9me2的相对表达量均下调，差异均具有统计学意义（均P<0.01）。与LSD1去甲基化片段缺失组相比，LSD1过表达组LSD1蛋白的相对表达量无明显变化，差异无统计学意义（P>0.05），下游蛋白H3K4me1、H3K4me2、H3K9me1、H3K9me2的相对表达量均下调，差异均具有统计学意义（均P<0.01）。（图4）
Ⓐ、Ⓑ—LSD1蛋白表达结果；Ⓒ~Ⓖ—H3K4me1、H3K4me2、H3K9me1、H3K9me2蛋白表达结果；1—空白对照组；2—LSD1去甲基化片段缺失组；3—LSD1过表达组；LSD1—赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶1。与空白对照组比较，aP<0.01；与LSD1去甲基化片段缺失组比较，bP<0.01
实时定量PCR结果显示：与空白对照组相比，LSD1去甲基化片段缺失组与LSD1过表达组HEK293T细胞中LSD1 mRNA的相对表达量均上调，差异均具有统计学意义（均P<0.01）；而LSD1去甲基化片段缺失组与LSD1过表达组间LSD1 mRNA的相对表达量差异无统计学意义（P>0.05）。（图5）
1—空白对照组；2—LSD1去甲基化片段缺失组；3—LSD1过表达组；LSD1—赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶1。与空白对照组比较，aP<0.01
表观遗传改变与多种肿瘤的发生和发展相关。表观遗传能对基因产生可逆性修饰调节，从而激活或阻断靶基因的转录与翻译，在肿瘤的发生、发展中发挥重要作用。
LSD1是调节表观遗传的重要基因。多项研究结果表明，多种肿瘤中存在LSDl的异常表达，LSDl可促进肿瘤细胞的迁移、侵袭和浸润，并与肿瘤复发及患者预后密切相关。LSD1能与雄激素受体作用，促进前列腺上皮细胞和前列腺癌细胞雄激素依赖的基因转录，而靶向沉默LSD1基因则能抑制雄激素依赖的基因转录激活和细胞增殖。Wang等[17]在对乳腺癌的研究中发现，LSD1/核小体重组和脱乙酰基酶（NuRD）复合物会影响乳腺癌细胞的迁移及侵袭。类似地，LSD1在非细胞肺癌及肝癌中的过表达能促进细胞增殖，并与患者的总存活数减少相关[18]。此外，LSD1过表达还可通过调控参与染色体修饰通路中的多种基因促进肿瘤的发生。相反，抑制LSD1（如LSD1抑制剂）会使多种肿瘤细胞的迁移能力降低。
LSD1基因去甲基化功能区域在结构上高度保守，这对LSD1发挥甲基化功能至关重要。由于LSD1在肿瘤发生、增殖、转移和抗凋亡过程中发挥着重要作用，故其有望成为肿瘤治疗的新分子靶标。探究去甲基化功能区域的缺失对于进一步了解LSD1基因以及阐释LSD1与相关疾病的关联具有重要意义。
大量研究结果证实，靶向沉默LSD1的表达或抑制LSD1的酶活性能有效抑制肿瘤的生长和转移。为了研究LSD1在疾病发生、发展过程中的作用以及LSD1去甲基化的作用，本研究构建了大鼠特异性LSD1过表达质粒与LSD1去甲基化片段缺失质粒，并通过了测序验证。Western Blot与实时定量PCR检测结果表明，与空白对照组相比，转染细胞的LSD1蛋白与mRNA均实现了过表达，为下一步研究大鼠中LSD1与相关疾病的关系以及LSD1去甲基化功能对LSD1的整体重要性提供了基础。
利益冲突 无
