研究转化生长因子-β3（TGF-β3）对体外培养的兔牙髓干细胞（DPSCs)成骨向分化的影响。
采用酶消化法分别将兔牙髓与颅骨分离培养获得DPSCs与成骨细胞（OB），通过光镜观察细胞形态，免疫组化染色和茜素红染色对OB进行鉴定。取第3代DPSCs与OB，分为3组：DPSCs组（空白对照组）、OB组（阳性对照组）及DPSCs+TGF-β3组（实验组）。培养第5天采用免疫组化染色检测各组细胞内Runt相关转录因子2（Runx-2）的表达；培养第7天采用碱性磷酸酶(ALP）活性测定试剂盒检测各组细胞内ALP的活性；培养第1、3、5、7天采用蛋白质印迹法（Western Blot）检测各组成骨特异性标志物Runx-2及TGF-β3蛋白的表达。
兔DPSCs多呈长梭形，突触多，OB多呈短梭形或成纤维样细胞形态，突触少而丰满；DPSCs与OB鉴定阳性。培养第5天，OB组与DPSCs+TGF-β3组细胞中的Runx-2蛋白表达均呈强阳性；培养第7天，两组细胞内的ALP活性差异无统计学意义（P>0.05）。Western Blot结果显示，培养各时间点DPSCs组与另外两组比较Runx-2和TGF-β3蛋白相对表达量差异均具有统计学意义（均P<0.05）；培养第7天，DPSCs+TGF-β3组Runx-2和TGF-β3蛋白相对表达量均高于另外两组，差异均具有统计学意义（均P<0.01）。
TGF-β3可促进DPSCs成骨早期特异性蛋白的表达。
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牙髓干细胞（dental pulp stem cells，DPSCs）具有与骨髓间充质干细胞极其相似的免疫表型及矿化结节形成能力[1]，其经不同条件诱导可向成骨细胞（osteoblast，OB）分化[2]。前期本课题组马蓉等[3]通过免疫组化法鉴定DPSCs，证实从兔牙髓细胞中可分离培养出DPSCs，并能在体外有效增殖。OB作为骨细胞的前体，在骨重建与骨修复中发挥着重要作用。多年来，对骨代谢的研究多以OB为基础[4]。转化生长因子-β3（transforming growth factor-β3，TGF-β3）是祖细胞的软骨形成分化的诱导因子，不仅可促进前体细胞的软骨形成及分化[5]、牙周组织再生[6]、DPSCs内碱性磷酸酶（alkailinephosphate，ALP）和Ⅰ型胶原酶的表达，还可延缓间充质干细胞向脂肪细胞转化[7]。本课题组前期通过体内外实验结果证实，TGF-β3可诱导DPSCs成骨向分化，且以80 ng/ml TGF-β3的诱导能力最强[8,9,10,11,12]。然而，目前尚无关于TGF-β3对DPSCs成骨早期蛋白表达的影响报道，故笔者对此进行研究，以期为DPSCs成骨向分化早期应用于临床提供基础证据。
健康清洁级1周龄新西兰幼兔2只，雌雄不限，体质量范围0.5~0.8 kg，购于新疆医科大学实验动物中心，许可证号为SCXK（新）2011-0004。胎牛血清（美国HyClone公司），DMEM-F12培养基、磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）（美国BI公司），Ⅰ型胶原酶（美国Worthington公司），分散酶Ⅱ、茜素红、十二烷基硫酸钠制胶试剂盒（北京索莱宝科技有限公司），TGF-β3（美国Peprotech公司），二喹啉甲酸蛋白含量检测试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司），ALP活性测定试剂盒（南京建成生物工程研究所），兔抗兔骨涎蛋白（bonesialoprotein，BSP）多克隆抗体、兔抗兔Runt相关转录因子2（Runt-related transcription factor 2，Runx-2）多克隆抗体（武汉博士德生物工程有限公司），兔抗小鼠TGF-β3多克隆抗体（英国Abcam公司），生物素标记的山羊抗兔IgG（H+L）抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（H+L）抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司）。本研究经深圳市罗湖区人民医院动物伦理委员会审批通过。
DMI4000B倒置荧光显微镜（德国Leica公司），GNP9080细胞培养箱（杭州蓝天仪器有限公司），AG22331 Hamburg低速离心机（德国Eppendorf公司）。
实验用新西兰幼兔(10日龄)的饲养条件为室内温度20~26 ℃，相对湿度50%~70%，每天光照8 h，自由母乳喂养。将幼兔处死后，以体积分数为75%的乙醇浸泡幼兔头部10 min，于超净台无菌条件下取兔上、下颌骨，PBS冲洗，体积分数为2%的双抗浸泡2 h；再于超净台中取出组织，刮净表面软组织，用体积分数为2%的双抗冲洗。然后采用酶解组织块法[3]获取DPSCs，具体方法如下：用剪刀剪去约1 mm根尖颌骨，拔出牙髓，浸泡于完全培养基（含体积分数为10%胎牛血清和1%双抗的DMEM-F12培养基）中；将牙髓组织剪成约1 mm×1 mm×1 mm小块，转入15 ml离心管中（管中预先加入质量浓度为3.0 g/L的Ⅰ型胶原酶和2.2 g/L的分散酶Ⅱ各1 ml），混匀后置于37 ℃摇床中消化；45 min后将悬液经200目筛网进行过滤，滤液以150× g离心5 min；将细胞沉淀用完全培养基重悬后移入25 cm培养瓶中进行培养，贴壁后于倒置荧光显微镜下观察；待细胞长至80%~90%后，用质量浓度为2.5 g/L的胰酶消化传代，收集第3代DPSCs用于后续研究。
在上述相同实验条件下取幼兔颅骨，将骨片剪成约1 mm×1 mm×1 mm小块，转入15 ml离心管中，37 ℃条件下用质量浓度为2.5 g/L的胰酶消化2次，弃上清；加入质量浓度为4.0 g/LⅠ型胶原酶（4 ml）与2.5 g/L胰酶（1 ml）的混合液，于37 ℃摇床中消化，60 min后收集上清液，加入完全培养基终止消化；将悬液经200目筛网过滤，滤液以150× g离心5 min；将细胞沉淀用完全培养基重悬移入25 cm培养瓶中进行培养，贴壁后观察细胞形态；待细胞长至80%~90%后，用质量浓度为2.5 g/L的胰酶消化传代，收集第3代OB用于后续研究。
取第1代OB以1×103个/孔的密度接种于24孔板中进行培养，3 d后以PBS冲洗；加入质量浓度为40 g/L的多聚甲醛固定30 min，PBS冲洗；加入含质量浓度为50 g/L牛血清白蛋白的PBS封闭30 min，分别加入兔抗兔Runx-2及BSP多克隆抗体150 μl，4 ℃过夜；加入生物素标记的山羊抗兔IgG（H+L）抗体室温孵育1 h，再经二氨基联苯胺显色、苏木素染色、自来水冲洗后于倒置荧光显微镜下观察并拍照，每组实验重复3次。
取第1代OB以1×105个/孔的密度接种于6孔板中进行培养，3 d后以PBS清洗；加入质量浓度为40 g/L的多聚甲醛固定30 min，PBS冲洗；加入1 ml茜素红染液染色5 min，蒸馏水冲洗、干燥后于倒置荧光显微镜下观察矿化结节并拍照，每组实验重复3次。
取第3代DPSCs与OB，分为3组：①DPSCs组（空白对照组），采用完全培养基进行培养。②OB组（阳性对照组），也采用完全培养基进行培养。③DPSCs+TGF-β3组（实验组），采用含质量浓度为80 ng/ml TGF-β3的完全培养基进行培养。
取第3代DPSCs与OB，按1.2.4进行分组，采用免疫组化染色检测培养第5天各组细胞中Runx-2蛋白的表达情况，具体操作同1.2.3（一），每组实验重复3次。
取第3代DPSCs与OB，按1.2.4进行分组，将细胞以5×104个/孔的密度接种于24孔板中进行培养，7 d后弃上清；加入体积分数为0.1%的Triton X-100裂解40 min；收集裂解液，按ALP活性测定试剂盒说明书进行操作，采用酶标仪检测各组裂解液于520 nm处的吸光度（A）值。根据公式计算细胞内ALP活性，每组实验重复3次。
取第3代DPSCs与OB，按1.2.4进行分组，将细胞以1×105个/孔的密度接种于10 cm培养皿中，分别培养1、3、5、7 d；提取各组细胞的全蛋白，测定各样本的蛋白浓度，根据样本量加入4×上样缓冲液，100 ℃变性10 min；取20 μg蛋白样品，采用12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离；再将蛋白转移至聚偏氟乙烯膜上，采用含质量浓度为50 g/L脱脂奶粉的1×TBST（含体积分数为0.5%吐温20的三羟甲基氨基甲烷缓冲液）室温封闭2 h；分别加入兔抗小鼠TGF-β3多克隆抗体与兔抗兔Runx-2多克隆抗体，4℃过夜，1×TBST漂洗；加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（H+L）抗体，避光孵育2 h，1×TBST漂洗；ECL显色，曝光时间视实验效果而定，使用Image-Pro plus 6.0软件分析各条带灰度值，每组实验重复3次。
采用SPSS 20.0统计学软件处理数据，符合正态分布的计量资料以均值±标准差（
±s）表示，对培养第7天各组细胞内的ALP活性及同组细胞培养第1、3、5、7天的蛋白条带灰度值分别进行单因素方差分析，组组之间的蛋白条带灰度值采用LSD比较，以P<0.05为差异具有统计学意义。
倒置荧光显微镜察结果显示，DPSCs多呈长梭形，也可为多角形，细胞核居中，多呈椭圆形，细胞呈集落生长，增殖快，原代培养7 d即可传代；OB形态不规则，多呈短梭形、三角形及成纤维样细胞形态，突触短而丰满，细胞核呈圆形或椭圆形，核大，细胞呈集落生长，原代培养10 d可传代。（图1）
如图2所示，Runx-2、BSP免疫组化及茜素红染色结果均呈阳性，证实自幼兔颅骨细胞中分离培养出OB。
免疫组化染色结果显示，培养第5天DPSCs组细胞中Runx-2蛋白表达呈弱阳性，而OB组与DPSCs+TGF-β3组细胞中Runx-2蛋白表达呈强阳性。（图3）
DPSCs—牙髓干细胞；TGF-β3—转化生长因子-β3
ALP活性检测结果显示，培养第7天DPSCs组细胞内ALP活性低于OB组和DPSCs+TGF-β3组（25.72±0.01比59.16±0.47，25.72±0.01比50.09±0.42；均P<0.01），OB组细胞内ALP活性略高于DPSCs+TGF-β3组（59.16±0.47比50.09±0.42），但两组间差异无统计学意义（P>0.05）。
蛋白质印迹法（Western Blot）检测结果显示，DPSCs组细胞中Runx-2蛋白表达不明显，OB组与DPSCs+TGF-β3组细胞在不同培养时间均有Runx-2蛋白表达，且表达随着培养时间的延长升高，在培养第5天时表达最高；培养第5天OB组细胞中的Runx-2蛋白相对表达量高于DPSCs+TGF-β3组，但差异无统计学意义（P>0.05）；培养第7天DPSCs+TGF-β3组细胞中的Runx-2蛋白相对表达量高于OB组，差异具有统计学意义（P<0.01）。TGF-β3蛋白的表达趋势同Runx-2蛋白，但DPSCs+TGF-β3组细胞中的TGF-β3蛋白相对表达量在培养第7天时明显高于OB组，差异具有统计学意义（P<0.01）。上述结果表明，外源性TGF-β3可促进DPSCs中TGF-β3与Runx-2蛋白的表达。（图4）。
Runx-2—Runt相关转录因子2；TGF-β3—转化生长因子-β3；OB—成骨细胞；DPSCs—牙髓干细胞。与相同培养时间的DPSCs组比较，aP<0.05；与相同培养时间的OB组比较，bP<0.05
牙齿缺失是口腔科常见疾病，临床多以牙齿种植术进行修复。种植体植入颌骨后，需经3个月或更长时间才能达到骨整合，且种植体边缘骨还存在着不同程度吸收；临床大夫多通过骨移植来解决，但骨移植术存在损伤大及免疫排斥反应等缺点，近年来骨组织工程的发展为其带来了新生机。
OB是骨形成的主要细胞，可向周围分泌基质和纤维，将自身包埋于其中形成类骨质，再经钙盐沉积继而矿化形成骨组织。若OB生成不足或功能降低，将直接导致骨形成减少，因此OB在骨重建和骨修复中有着非常重要的地位，本研究以OB（膜内骨化）[13]作为阳性对照。
BSP是细胞外基质中一种富含末端唾液酸糖链结构的高度磷酸化和糖基化的分泌蛋白，在骨形成和骨改建中，BSP浓度最高，是骨新陈代谢的标志物。钙化结节的数量可代表最终矿化的程度。ALP是干细胞成骨向分化的早期标志性酶，Runx-2是调控前OB分化为OB的关键因子，可在形成骨矿化组织的间质和上皮组织的早期发育过程中表达，因此ALP及Runx-2在干细胞成骨向分化早期表达明显，后期表达降低。本课题组前期进行了体内实验研究，结果证明TGF-β3联合DPSCs在培养第5天时Runx-2蛋白表达最高；还通过检测成骨中晚期标志物BSP、骨钙素的表达及茜素红染色证实TGF-β3可促进DPSCs成骨向分化。因此，本研究选取成骨早期标志物ALP及Runx-2蛋白，进一步证实TGF-β3诱导DPSCs成骨向分化的能力。
本研究中，笔者通过免疫组化染色与茜素红染色从早、中、晚期鉴定OB为阳性。ALP活性检测与Runx-2蛋白免疫组化染色结果证实OB组与DPSCs+TGF-β3组细胞内ALP活性及Runx-2蛋白表达差异均无统计学意义，即TGF-β3可通过上调DPSCs内成骨早期标志物ALP活性及Runx-2蛋白表达来促进DPSCs成骨向分化。Western Blot结果显示：Runx-2蛋白表达情况与免疫组化染色结果一致；TGF-β3诱导DPSCs成骨与OB成骨比较，不仅Runx-2蛋白早期表达量无差异，还可延长DPSCs中Runx-2蛋白的表达，从而可长时间释放Runx-2促进DPSCs向前OB分化，进而向成骨分化；TGF-β3蛋白表达结果表明，采用外源性TGF-β3诱导DPSCs可促进DPSCs中TGF-β3蛋白的表达，进而促进DPSCs成骨向分化，这与本课题组前期研究结果一致[7]。
在骨组织工程中，OB具有十分重要的地位，但OB异体来源可能存在免疫排斥，自体来源损伤大且较难获取，而DPSCs来源广，虽存在异体免疫排斥，但可从自体牙髓中获取。本研究通过检测ALP标志酶活性和Runx-2标志蛋白表达证明了TGF-β3联合DPSCs可促进并延长成骨早期蛋白的表达，故TGF-β3联合DPSCs可代替OB成骨，为骨组织工程的种子细胞提供一项新选择，也为解决颌面部骨缺损以及缩短种植后骨愈合时间打下理论基础。因本研究进行的是体外实验，为应用于临床尚需进行更深入地发掘与临床试验。
利益冲突 无
