研究左卡尼汀（LCNT）与表柔比星（EPI）联合用药对人肺腺癌GLC-82和A549细胞增殖和凋亡的影响。
分别将GLC-82和A549细胞分为空白对照组、EPI组、LCNT组和EPI+LCNT组，给予对应药物作用24 h后采用噻唑蓝实验检测细胞增殖情况，流式细胞术检测细胞周期和早期凋亡情况，蛋白质印迹法检测P53和Bcl-2蛋白的表达。
与空白对照组比，单独给药LCNT能促进GLC-82细胞的增殖，20.00 μg/ml LCNT作用24 h后GLC-82细胞的增殖率为37.56%（P<0.01)，而A549细胞的增殖率仅为6.32%，差异无统计学意义（P>0.05）。EPI联合LCNT可减弱EPI对GLC-82细胞增殖的抑制作用，联合作用24 h后GLC-82细胞的增殖抑制率较EPI组降低了12.14%(P<0.05）。与EPI组相比，EPI联合LCNT可使GLC-82和A549细胞的G0/G1期比例明显升高[GLC-82：（50.42±1.21）%比（25.94±0.66）%，P<0.01；A549：（54.92±1.71）%比（38.63±0.69）%，P<0.01]，GLC-82细胞的S期比例降低[（34.21±0.96）%比（59.68±1.25）%, P<0.05]，并阻止GLC-82细胞早期凋亡，而不影响A549细胞的凋亡。与EPI组相比，EPI+LCNT组GLC-82和A549细胞中P53蛋白表达均下调（均P<0.05），但EPI+LCNT组GLC-82细胞中Bcl-2蛋白表达明显上调（P<0.01），而A549细胞中Bcl-2蛋白表达无明显变化（P>0.05）。
LCNT与EPI联用可减弱EPI对GLC-82细胞的增殖抑制作用和诱导凋亡作用，而对A549细胞无明显影响。LCNT能促进GLC-82细胞增殖，并使其细胞周期阻滞于G0/G1期，其机制可能与下调P53蛋白和上调Bcl-2蛋白的表达有关。
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肺癌是全球最常见的恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的主要原因，每年约有超过180万例新增肺癌病例（占所有肿瘤的13.0%）和160万例肺癌相关死亡病例（占所有肿瘤的19.4%）[1,2,3]。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）是肺癌最常见的类型，约占肺癌总数的85%。对于晚期NSCLC患者而言，化学药物治疗（化疗）为主要治疗方案之一。临床常采用左卡尼汀（L-carnitine，LCNT）来预防化疗药物对心肌的损伤作用。LCNT是一种特殊的氨基酸，是哺乳动物能量代谢中必需的体内天然物质，其主要功能是促进脂类代谢。游离LCNT可使堆积的脂酰辅酶A进入线粒体内，减少其对腺嘌呤核苷酸转位酶的抑制，从而使氧化磷酸化得以顺利进行。LCNT还能增加还原型辅酶Ⅰ细胞色素C还原酶和细胞色素氧化酶的活性、加速腺苷三磷酸的产生、阻止或减少抗肿瘤药物诱发的急慢性心肌病变的发生[4,5,6]。然而，关于LCNT与抗肿瘤药物联用后对肿瘤细胞是否有影响，仍缺乏基础研究依据。本研究旨在探讨LCNT与表柔比星（epirubicin，EPI）联用对人肺腺癌GLC-82和A549细胞增殖变化及细胞周期的影响，为临床制定NSCLC的个体化治疗方案提供依据。
人肺腺癌GLC-82细胞和A549细胞（天津市肿瘤研究所免疫室提供），注射用盐酸EPI[批号120201401，辉瑞制药（无锡）有限公司]，LCNT注射液（批号201404251，常州兰陵制药有限公司），氯化钠注射液（批号9J90A，中国大冢制药有限公司），RPMI-1640培养液、磷酸缓冲液（phosphate buffered saline, PBS）（天津百若克医药生物技术有限责任公司），噻唑蓝（thiazolyl blue tetrazolium bromide, MTT）（北京中生瑞泰科技有限公司），碘化丙啶/核糖核酸酶染色缓冲液（美国BD公司），兔抗人P53单克隆抗体、兔抗人Bcl-2单克隆抗体（美国CST公司），兔抗人β-肌动蛋白单克隆抗体（美国Abcam公司），辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（H+L）抗体（上海碧云天生物技术有限公司）。
Midi40 CO2培养箱（美国Thermo Electron公司），DMIL HC倒置相差显微镜（德国Leica公司），FACS Caliber流式细胞仪（美国BD公司），Model 680全自动酶标仪（美国Bio-Rad公司），CP225D电子分析天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]。
将注射用EPI溶于适量氯化钠注射液中，使EPI终质量浓度为1 mg/ml，过滤除菌后于4 ℃冰箱密封避光保存。LCNT注射液中LCNT的质量浓度为0.2 g/ml。使用前采用RPMI-1640培养液（不含胎牛血清）分别对上述EPI溶液和LCNT注射液进行稀释，使EPI的质量浓度依次为32.000、16.000、8.000、4.000、2.000、1.000、0.500、0.250、0.125 μg/ml，LCNT的质量浓度依次为80.00、40.00、20.00、10.00、5.00、2.50、1.25 μg/ml，由质量浓度高到低梯度稀释。
人肺腺癌GLC-82细胞和A549细胞均采用含体积分数为10%胎牛血清的RPMI-1640培养液，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，待贴壁生长均匀后进行传代培养。
分别取对数生长期的GLC-82细胞和A549细胞，消化制成单细胞悬液后计数，调整细胞浓度为1×104个/ml，按每孔200 μl接种于96孔板中，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养48 h；吸弃培养液，设空白对照组、EPI组和LCNT组，空白对照组加入200 μl PBS，EPI组和LCNT组分别加入等体积含不同质量浓度EPI和LCNT的培养液，继续培养24 h，于倒置相差显微镜下观察肿瘤细胞形态；加药培养24 h后，每孔加入20 μl用PBS配制的MTT溶液（5 mg/ml），继续孵育4 h；小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入150 μl二甲基亚砜，振荡10 min，使结晶物充分溶解；采用全自动酶标仪测定各孔于570 nm处的吸光度（A）值，按以下公式计算细胞增殖率和抑制率
式中：A给药组和A对照组分别为给药组和对照组于570 nm处的吸光度值。再以药物质量浓度为横坐标、抑制率为纵坐标绘制细胞生长曲线。每组设6个复孔，实验重复3次，拟合曲线后求药物半数抑制浓度（IC50）值和20%抑制浓度（IC20）值。采用同样方法检测EPI联合LCNT作用GLC-82和A549细胞24 h的细胞增殖抑制率。设对照组（EPI组）和EPI+LCNT组，其中EPI给药质量浓度分别为其作用上述两种细胞24 h的IC50值，LCNT的质量浓度分别为2.50、5.00、10.00、20.00、40.00 μg/ml。
分别取对数生长期的GLC-82细胞和A549细胞，调整细胞浓度为2×105个/ml，按每孔2 ml接种于6孔板中，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养48 h；吸弃培养液，设空白对照组、EPI组、LCNT组和EPI+LCNT组，空白对照组加入2 ml PBS，其余各组分别加入等体积含对应药物的培养液，其中EPI给药质量浓度分别为其作用GLC-82和A549细胞24 h的IC50值，LCNT取GLC-82和A549细胞增殖率最高值对应的质量浓度（20.00 μg/ml），于37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h；每孔加入200 μl胰酶消化3~5 min，再加入500 μl PBS吹打细胞至完全脱落，将细胞悬液转至1.5 ml离心管中，4 ℃、268× g离心10 min；弃上清，PBS洗2次，加入800 μl体积分数为70%的冷乙醇，混匀使细胞悬浮固定，4 ℃过夜；弃去固定液，加入800 μl 4 ℃预冷的PBS重悬细胞；加入400 μl核糖核酸酶缓冲液（含质量浓度为50 μg/ml的溴化乙锭、100 μg/ml的核糖核酸酶A和体积分数为0.2%的Triton X-100），4 ℃避光染色30 min，经400目滤网过滤后上流式细胞仪检测。激发波长为488 nm，发射波长为630 nm，实验重复3次。
按1.2.4节分组给药作用24 h后，消化收集各组细胞，3 350× g离心10 min，弃上清，PBS洗涤细胞；加入50 μl细胞裂解液，于冰上充分裂解；4 ℃、3 350× g离心15 min，取上清测定蛋白浓度后置于-80 ℃保存；采用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离各组蛋白样品，转膜后用脱脂牛奶封闭过夜；PBS洗膜，分别加入兔抗人P53和Bcl-2单克隆抗体，4 ℃孵育过夜；PBS洗膜，再分别加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（H+L）抗体，室温孵育2 h；PBS洗膜，加入显色液显影，以β-肌动蛋白作为内参，用Gel-Pro Analyzer 3.0软件分析各显影条带的灰度值。
采用SPSS17.0统计学软件处理数据，符合正态分布的计量资料以均值±标准差（Mean±SD）表示，两组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。
MTT实验结果显示，GLC-82和A549细胞分别经EPI和LCNT单独处理24 h后，不同质量浓度的EPI对这两种细胞的增殖均具有明显抑制作用；EPI作用GLC-82和A549细胞24 h的IC50值分别为11.45 μg/ml和27.14 μg/ml，IC20值分别为2.51 μg/ml和6.76 μg/ml（图1）。而不同质量浓度的LCNT对GLC-82和A549细胞的增殖均具有一定的促进作用，其中对GLC-82细胞的增殖促进作用较明显，且增殖促进作用达一定阈值后逐渐减弱；对A549细胞增殖影响则不明显（图2）。与空白对照组相比，LCNT（20.00 μg/ml）作用24 h后GLC-82细胞的增殖率为37.56%，差异具有统计学意义（P<0.01），而A549细胞的增殖率仅为6.32%，差异无统计学意义（P>0.05）（图2）。
GLC-82和A549细胞分别经给药处理24 h后，与EPI组相比，EPI联合不同质量浓度的LCNT对GLC-82细胞增殖的抑制率降低，且随着LCNT质量浓度的增加，细胞毒性作用逐渐减弱；EPI联合LCNT（20.00 μg/ml）对GLC-82细胞增殖的抑制率较EPI组降低了12.14%，差异具有统计学意义（P<0.05）；而EPI联合LCNT给药对A549细胞增殖的抑制率无明显变化，差异均无统计学意义（均P>0.05）（图3）。上述结果表明：EPI联合LCNT给药对不同来源的人肺腺癌细胞GLC-82和A549增殖的影响具有差异性，其中对GLC-82细胞增殖的影响与药物浓度密切相关，EPI+LCNT（20.00 μg/ml）组的抑制率变化明显；而对A549细胞增殖无明显影响。GLC-82和A549细胞分别经给药处理24 h后的细胞形态学观察结果也表明，LCNT能促进GLC-82细胞的增殖，EPI联合不同质量浓度的LCNT给药后，GLC-82细胞核皱缩和细胞死亡数均减少，而LCNT单独给药和EPI联合LCNT给药对A549细胞均无明显影响（图4）。
1—EPI；2—EPI+LCNT（2.50 μg/ml）；3—EPI+LCNT（5.00 μg/ml）；4—EPI+LCNT（10.00 μg/ml）；5—EPI+LCNT（20.00 μg/ml）；6—EPI+LCNT（40.00 μg/ml）；EPI—表柔比星；LCNT—左卡尼汀。EPI给药质量浓度分别为EPI作用GLC-28和A549细胞24 h的半数抑制浓度值（11.45 μg/ml和27.14 μg/ml）。与EPI组比较，aP<0.05
EPI—表柔比星；LCNT—左卡尼汀。EPI给药质量浓度分别为EPI作用GLC-28和A549细胞24 h的半数抑制浓度值（11.45 μg/ml和27.14 μg/ml），LCNT给药质量浓度为20.00 μg/ml
GLC-82和A549细胞分别经给药处理24 h后，采用流式细胞术碘化丙啶单染法分析细胞周期及早期凋亡变化。结果如表1所示：与空白对照组相比，EPI组GLC-82细胞的G0/G1期比例明显降低，S期细胞比例明显升高，差异均具有统计学意义（均P<0.01），而G2/M期细胞比例无明显变化，差异无统计学意义（P>0.05）；EPI组A549细胞的G0/G1期比例降低，S期细胞比例升高，差异均具有统计学意义（均P<0.01）。文献报道，G1峰前出现亚二倍体峰Sub-G1为细胞发生早期凋亡的标志。由表1可知：与空白对照组相比，LCNT（20.00 μg/ml）使G0/G1期细胞比例升高，G2/M期细胞比例降低，差异均具有统计学意义（均P<0.05），且无亚二倍体峰，表明LCNT可能通过促进GLC-82细胞的RNA合成，进而促进细胞的有丝分裂。此外，与EPI组相比，EPI+LCNT组GLC-82细胞的G0/G1期比例明显升高（P<0.01），S期细胞比例降低（P<0.05），差异均具有统计学意义，同时G1峰前出现的亚二倍体峰消失；而EPI+LCNT组A549细胞的G0/G1期比例升高，差异具有统计学意义（P<0.01），S期细胞比例无明显变化，差异无统计学意义（P>0.05），且G1峰前出现的亚二倍体峰未消失。上述结果表明：EPI联合LCNT给药对人肺腺癌GLC-82和A549细胞周期分布和早期凋亡的影响也具有差异性，联合给药对这两种细胞的S期分布影响不同，同时可抑制EPI诱导GLC-82细胞早期凋亡的作用，而对EPI诱导A549细胞早期凋亡无抑制作用。
EPI联合LCNT作用24 h对人肺腺癌GLC-82和A549细胞周期分布的影响（%，Mean±SD，n=3）
EPI联合LCNT作用24 h对人肺腺癌GLC-82和A549细胞周期分布的影响（%，Mean±SD，n=3）
| 组别 | GLC-82细胞 | A549细胞 | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| G0/G1 | S | G2/M | Sub-G1 | G0/G1 | S | G2/M | Sub-G1 | |
| 空白对照组 | 60.23±1.12 | 24.61±0.78 | 15.16±0.36 | — | 56.41±1.67 | 26.78±0.87 | 16.81±0.32 | — |
| LCNT祖 | 70.91±2.91a | 22.43±3.98 | 6.66±0.96a | — | 66.82±1.35a | 24.26±0.64 | 8.92±0.28a | — |
| EPI组 | 25.94±0.66b | 59.68±1.25b | 15.38±0.75 | 6.44±0.11 | 38.63±0.69b | 40.46±0.52b | 20.91±0.32 | 4.13±0.09 |
| EPI+LCNT组 | 50.42±1.21ad | 34.21±0.96ac | 15.37±0.86 | — | 54.92±1.71d | 38.36±0.63b | 6.72±0.27ad | 7.52±0.15 |
注：EPI—表柔比星；LCNT—左卡尼汀；Sub-G1—G1峰前的亚二倍体峰；"—"指无此项。EPI给药质量浓度分别为EPI作用GLC-28和A549细胞24 h的半数抑制浓度值（11.45 μg/ml和27.14 μg/ml），LCNT给药质量浓度为20.00 μg/ml。与空白对照组比较，aP<0.05，bP<0.01；与EPI组比较，cP<0.05，dP<0.01
蛋白质印迹检测结果如图5所示：与空白对照组相比，EPI组GLC-82和A549细胞中P53蛋白表达均明显上调（均P<0.01），Bcl-2蛋白表达均下调（均P<0.05），差异均具有统计学意义；与EPI组相比，EPI+LCNT组GLC-82和A549细胞中P53蛋白表达均下调（均P<0.05），但EPI+LCNT组GLC-82细胞中Bcl-2蛋白表达明显上调（P<0.01），而A549细胞中Bcl-2蛋白表达无明显变化，差异无统计学意义（P>0.05）。因此，LCNT联合EPI可通过上调GLC-82细胞中Bcl-2蛋白的表达，进而减弱EPI对肿瘤细胞的杀伤作用，但对于A549细胞中Bcl-2蛋白的表达无明显影响。
EPI—表柔比星；LCNT—左卡尼汀。EPI给药质量浓度分别为EPI作用GLC-28和A549细胞24 h的半数抑制浓度值（11.45 μg/ml和27.14 μg/ml），LCNT给药质量浓度为20.00 μg/ml。与空白对照组比较，aP<0.01，bP<0.05；与EPI组比较，cP<0.05，dP<0.01
随着肿瘤分子诊断技术和基因检测技术的发展，靶向精准和个体化治疗已成为未来的发展趋势。肺癌靶向治疗的基本思路是在不断发现精确靶点的基础上采取精准治疗，而肿瘤个体化治疗的关键在于联合用药的合理性，同时将不良反应降至最低。人肺腺癌A549和GLC-82细胞均属于NSCLC细胞系，其来源和诱因均不同。A549细胞为上皮样、多角形，呈贴壁生长；而GLC-82细胞为上皮样、卵圆形，呈贴壁生长。染色体涂色结果表明，在A549和GLC-82细胞中发生了复杂的染色体重排，除正常染色体拷贝数发生变化外，还分别存在13条和24条畸变染色体，但它们似共享两个染色体易位断裂点（HSA8q24和12q14）[7,8]。
细胞周期的阻滞与细胞凋亡、分化密切相关，许多分化诱导剂可通过抑制细胞原癌基因或诱导抑癌基因的表达阻滞细胞周期，减少有丝分裂，从而诱导肿瘤细胞分化[9,10]。P53蛋白在某些细胞的增殖周期调控过程中起着关键作用，有文献报道，P53蛋白的高表达可使肿瘤细胞的生长速度减慢、血清依赖性增加、单细胞克隆集落形成能力降低、非锚定依赖性生长能力减弱和S期进程减缓，在一定程度上抑制细胞周期蛋白D1（cyclin D1）和细胞周期蛋白依赖性激酶2（CDK2）的表达[11,12]。
本研究结果表明，不同质量浓度的LCNT对GLC-82和A549细胞增殖均有一定的影响，但具有明显差异性，即对GLC-82细胞增殖有明显促进作用。细胞从有丝分裂到DNA复制之前，G1期合成核糖体RNA、信使RNA、转运RNA及核蛋白体，同时糖元合成最为显著，此外G1期也是化学药物作用的敏感点[13,14]。本研究结果表明，EPI联合LCNT给药对人肺腺癌GLC-82和A549细胞周期分布和早期凋亡的影响也具有差异性。联合给药可使GLC-82细胞G0/G1期比例明显升高，S期比例降低，亚二倍体峰消失。此外，与EPI组相比，EPI联合LCNT给药可使GLC-82和A549细胞中P53蛋白表达均下调；还可使GLC-82细胞中Bcl-2蛋白表达明显上调，但对A549细胞中Bcl-2蛋白表达无明显影响，这可能与来源、诱因均不同的这两株人肺腺癌细胞内复杂的染色体重排相关。由此可见，LCNT能促进GLC-82细胞增殖，减弱EPI抑制细胞增殖的作用，并使其细胞周期阻滞于G0/G1期，其机制可能与下调P53蛋白表达和上调Bcl-2蛋白表达有关。
综上所述，EPI联合LCNT给药对人肺腺癌GLC-82和A549细胞的增殖、细胞周期分布和早期凋亡的影响具有差异性。后续研究还需建立动物模型的整体评价，进一步探讨作用差异性的机制，为肺癌患者个体化治疗提供理论依据。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
