构建定点敲入血管内皮生长因子165（VEGF165）基因的人肾上皮细胞系HEK293T，避免由慢病毒感染等方法实现过表达时所带来的脱靶效应。
根据EZH2基因的DNA序列设计、构建两端带有同源臂的VEGF165表达载体（pUCm-T-VEGF165质粒）和能定点切割基因组DNA的小向导RNA(sgRNA)表达载体[pSpCas9（BB）-2A-Puro-sgRNA质粒]，再将这两个质粒共转染HEK293T细胞，通过实时荧光定量PCR检测VEGF165和EZH2的mRNA表达情况，蛋白质印迹法（Western Blot）检测VEGF165和EZH2的蛋白表达情况。
实时荧光定量PCR和Western Blot结果显示，与对照组、单独转染pUCm-T-VEGF165质粒和pSpCas9（BB）-2A-Puro-sgRNA质粒组比较，共转染pUCm-T-VEGF165和pSpCas9（BB）-2A-Puro-sgRNA质粒组VEGF165的mRNA和蛋白相对表达量均升高（VEGF165 mRNA：3.42±0.30比1.02±0.21、1.13±0.16、0.98±0.18，均P<0.01；VEGF165蛋白：3.12±0.10比1.02±0.06、0.88±0.03、0.80±0.05，均P<0.01），EZH2的mRNA和蛋白相对表达量均降低（EZH2 mRNA：0.14±0.06比1.08±0.11、1.02±0.12、1.13±0.16，均P<0.01；EZH2蛋白：0.23±0.03比1.05±0.13、0.91±0.04、0.81±0.06，均P<0.01）。该结果表明VEGF165基因被定点插入EZH2基因的基因组DNA序列中，并干扰了EZH2的表达。
采用CRISPR/Cas9系统成功构建了定点敲入VEGF165基因的HEK293T细胞系。
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CRISPR/Cas9系统是原核生物抵抗外源质粒DNA和噬菌体的一种免疫机制[1]。小向导RNA（small guide RNA，sgRNA）序列可通过互补配对的方法引导CRISPR/Cas9系统进行DNA切割位点定位，而后Cas9酶将结合至该位点对DNA进行切割。因此可人工设计合成sgRNA，并借助CRISPR/Cas9系统在细胞内实现基因的敲除、沉默以及过表达[2]。
烟雾病是一种脑底动脉（Willis）环前部循环血管狭窄和闭塞的疾病。其血管病理性收缩会影响血液的正常循环，作为一种代偿机制在堵塞血管的周围常生成血管，建立侧支循环。但这些代偿性侧支循环的血管较小，常会诱发动脉瘤和血栓的形成。烟雾病主要表现为病变血管的间质萎缩变薄、血管内弹力层弯曲、内膜明显增厚、血管壁上出现脂质沉积及附壁血栓等[3]。目前，烟雾病的发病原因尚未清楚，可能与遗传和环境因素有关。研究其发病原因有助于进一步认识其发病机理。
血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）作为一种信号蛋白，可刺激血管的形成[4]。VEGF是由两条相对分子质量均为24 ku的单链组成的高度保守的二聚体糖蛋白[5]。由于其mRNA的剪切方式不同，形成了VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF189和VEGF206等多种亚型。其中VEGF121、VEGF145和VEGF165是分泌型可溶性蛋白，可直接作用于血管内皮细胞，进而促进血管内皮细胞增殖，增加血管通透性。过表达VEGF有可能进一步促进血管的生成，改善血栓、堵塞等症状。
表观遗传是指在DNA序列不发生改变的前提下，引起的可遗传的基因表达或细胞表型变化，如DNA修饰、组蛋白修饰、RNA干扰等[6]。EZH2（enhancer of zeste homolog 2）作为多梳蛋白抑制复合物2（PRC2）的重要组分，可通过对组蛋白H3的第27位赖氨酸进行甲基化修饰调节多种基因的表达水平[7]。EZH2在多种肿瘤中表达异常，已成为肿瘤研究的热点[8]，但其在烟雾病中的作用研究尚未见报道。
本研究采用CRISPR knockin技术定点敲入VEGF165基因，以避免采用慢病毒感染等常规方法实现基因过表达时外源基因整合进入基因组的位点具有随机性，从而提高研究结果的可靠性，为烟雾病发病机理的研究提供理论基础。
DH5α感受态细胞、超高保真DNA聚合酶（Phanta® EVO HS Super-Fidelity DNA Polymerase）、实时荧光定量PCR试剂盒[AceQ® qPCR SYBR® Green Master Mix（without ROX）]（南京诺唯赞生物科技有限公司），pSpCas9（BB）-2A-Puro载体（美国Addgene公司），pUCm-T载体、T载体PCR产物克隆试剂盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]，人肾上皮细胞HEK293T（美国模式培养物集存库），DNA纯化回收试剂盒、质粒中提试剂盒（美国Biomiga公司），RevertAid反转录酶、RNA提取试剂（TRIzolTM Reagent）、Lipofectamine® 2000转染试剂（美国Thermo Fisher Scientific公司），RPMI-1640培养基（美国Gibco公司），胎牛血清（德国PAN公司），小鼠抗人β-肌动蛋白单克隆抗体（美国Santa Cruz公司），小鼠抗人VEGF165单克隆抗体、兔抗人EZH2单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG（H+L）和山羊抗兔Ig（H+L）抗体（美国Abcam公司）。
ABI 7500 Fast实时荧光定量PCR系统（美国ABI公司），5810R冷冻离心机（德国Eppendorf公司），NanoDrop 2000微量核酸测定仪（美国Thermo Fisher Scientific公司），BX43光学显微镜（日本Olympus公司），SN210C立式压力蒸汽灭菌锅[雅马拓科技贸易（上海）有限公司]，Cytation 5微孔板检测仪（美国BioTek公司）。
采用TRIzol法从HEK293细胞中提取总RNA，再用RevertAid反转录酶反转录为互补DNA（complementary DNA，cDNA），并以该cDNA为模板，进行PCR扩增获得VEGF165编码区全长序列以及上下游同源臂序列。VEGF165正向引物为5’-ACTGGGAAGAAATCTGAGAAGGGACCAATGAACTTTCTGCTGTCTTGGGT-3’，反向引物为5’-TTTACACGCTTCCGCCAACAAACTCACCGCCTCGGCTTG-3’；扩增5’端同源臂序列，正向引物为5’-TAATGGGATCATGTTCCTATAATATGGCCG-3’，反向引物为5’-CCCAAGACAGCAGAAAGTTCATTGGTCCCTTCTCAGATTTCTTCC-3’；扩增3’端同源臂序列，正向引物为5’-GCAGATGTGACAAGCCGAGGCGGTGAGTTTGTTGGCGGAAGCGTGTAAA-3’，反向引物为5’-TAGAAACATAAAATCATGAAATGCATCCCT-3’。采用超高保真DNA聚合酶进行PCR扩增，反应体系为：模板DNA 1 μl，5 × EVO缓冲液（含有10 mmol/L MgCl2）10 μl，脱氧核糖核苷三磷酸混合液（4种碱基浓度均为10 mmol/L）1 μl，正反向引物（10 μmol/L）各2 μl，超高保真DNA聚合酶（1 U/μl）1 μl，H2O 33 μl。PCR反应条件为：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 60 s，30个循环；72 ℃ 7 min。将PCR产物进行DNA凝胶电泳，选取对应的DNA片段进行切胶回收。
采用重叠PCR方法将上述3段胶回收PCR产物进行连接，正向引物为5’-TAATGGGATCATGTTCCTATAATATGGCCG-3’，反向引物为5’-TAGAAACATAAAATCATGAAATGCATCCCT-3’。PCR反应条件与前述相同。将获得的重叠PCR产物连接至pUCm-T载体中，再将构建的pUCm-T-VEGF165表达载体转化DH5α感受态细胞，挑取单克隆菌落进行测序鉴定，序列正确后进行质粒中提。
采用CRISPR基因编辑技术将sgRNA序列设计在EZH2基因启动子下游序列，以达到同时敲除EZH2基因的目的。sgRNA序列为5’-ACACGCTTCCGCCAACAAAC-3’。根据Addgene公司网站提供的实验方法对pSpCas9（BB）-2A-Puro载体进行重组载体构建，再将构建的载体pSpCas9（BB）-2A-PurosgRNA转化DH5α感受态细胞，挑取单克隆菌落进行测序鉴定，序列正确后进行质粒中提。
HEK293T细胞采用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基，于37 ℃、5%CO2饱和湿度的条件下进行培养，每周换液2~3次。质粒转染过程按照Lipofectamine® 2000转染试剂说明书进行操作。
采用TRIzol法提取细胞总RNA，取1 μg总RNA反转录为cDNA，再采用SYBR® Green染料法进行实时荧光定量PCR检测。PCR反应体系为：SYBR® Green混合液10 μl，正向引物0.4 μl，反向引物0.4 μl，cDNA 2 μl，H2O 7.2 μl。反应条件为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 40 s，40个循环。以β-肌动蛋白为内参基因。采用2-ΔΔCT法计算基因的mRNA表达水平。每个样品设3个复孔，实验重复3次。引物序列见表1。
实时荧光定量PCR相关基因引物序列
实时荧光定量PCR相关基因引物序列
| 基因名称 | 引物序列（5 ’→3 ’） |
|---|---|
| VEGF165 | 正向引物：AAAACACAGACTCGCGTTGC |
| 反向引物：GCCTCGGCTTGTCACATCT | |
| EZH2 | 正向引物：GCTTCCTACATCGTAAGTGCAA |
| 反向引物：ATTAATGGTGGGGGTGCTGG | |
| β-肌动蛋白 | 正向引物：CTGGACTTCGAGCAAGAGAT |
| 反向引物：GATGTCCACGTCACACTTCA |
注：VEGF165—血管内皮生长因子165
转染48 h后，将细胞用磷酸盐缓冲液洗2次；收集细胞，加入上样缓冲液煮沸10 min；12 000× g离心20 min，取上清，经聚丙烯酰胺凝胶电泳后转移至聚偏氟乙烯膜上；用质量浓度为50 g/L的牛血清白蛋白4 ℃封闭过夜；分别加入免抗人EZH2单克隆抗体（稀释比例1∶2 000）、小鼠抗人VEGF165单克隆抗体（1∶2 000）、小鼠抗人β-肌动蛋白单克隆抗体（1∶5 000），4 ℃孵育过夜，用含吐温20的三羟甲基氨基甲烷缓冲液（TBST）洗膜3次，每次10 min；分别加入对应的二抗4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，每次10 min；采用ECL超敏发光液进行显色，并对X光片曝光、显影和定影，使用ImageJ 1.48u软件分析目的条带灰度值。
采用SSPS 19.0统计学软件处理数据，符合正态分布的计量数据均以均值±标准差（Mean±SD）表示，两组间比较采用t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。
DNA凝胶电泳结果显示，5’端同源臂序列（329 bp）、3’端同源臂序列（376 bp）、VEGF165编码区序列（626 bp）和重叠PCR连接产物（1 236 bp）大小均正确（图1）。
M—DNA Marker；1—5’端同源臂序列；2—3’端同源臂序列；3—VEGF165编码区序列；4—重叠PCR连接产物；VEGF165—血管内皮生长因子165
采用Lipofectamine® 2000转染试剂将pUCm-TVEGF165表达载体和构建好的pSpCas9（BB）-2A-Puro-sgRNA表达载体共转染至HEK293T细胞中，3周后分别采用实时荧光定量PCR和Western Blot检测VEGF165的mRNA和蛋白表达水平。结果显示，与对照组、单独转染pUCm-T-VEGF165质粒和pSpCas9（BB）-2A-Puro-sgRNA质粒组比较，共转染pUCm-T-VEGF165和pSpCas9（BB）-2A-Puro-sgRNA质粒组VEGF165的mRNA和蛋白相对表达量均升高，差异均具有统计学意义（VEGF165 mRNA：3.42±0.30比1.02±0.21、1.13±0.16、0.98±0.18，均P<0.01；VEGF165蛋白：3.12±0.10比1.02±0.06、0.88±0.03、0.80±0.05，均P<0.01），表明采用CRISPR knockin技术在HEK239T细胞中成功实现了VEGF165 mRNA和蛋白表达水平的提升（图2、图3）。
1—对照组；2—转染pUCm-T-VEGF165质粒组；3—转染pSpCas9（BB）-2A-Puro-sgRNA质粒组；4—共转染pUCm-T-VEGF165和pSpCas9（BB）-2A-Puro-sgRNA质粒组；VEGF165—血管内皮生长因子165；sgRNA—小向导RNA。与共转染组比较，aP<0.01
1—对照组；2—转染pUCm-T-VEGF165质粒组；3—转染pSpCas9（BB）-2A-Puro-sgRNA质粒组；4—共转染pUCm-T-VEGF165和pSpCas9（BB）-2A-Puro-sgRNA质粒组；VEGF165—血管内皮生长因子165；sgRNA—小向导RNA。与共转染组比较，aP<0.01
本研究采用CRISPR knockin技术将VEGF165基因定点敲入EZH2基因编码区，故将对EZH2的表达产生一定的影响。采用Lipofectamine® 2000转染试剂将pUCm-T-VEGF165表达载体和构建好的pSpCas9（BB）-2A-Puro-sgRNA表达载体共转染至HEK293T细胞中，3周后分别采用实时荧光定量PCR和Western Blot检测EZH2的mRNA和蛋白表达水平。结果显示，EZH2和β-肌动蛋白的融解曲线均为单峰，表明实时荧光定量PCR特异性良好。与对照组、单独转染pUCm-T-VEGF165质粒和pSpCas9（BB）-2A-Puro-sgRNA质粒组比较，共转染pUCm-T-VEGF165和pSpCas9（BB）-2A-Puro-sgRNA质粒组EZH2的mRNA和蛋白相对表达量均降低，差异均具有统计学意义（EZH2 mRNA：0.14±0.06比1.08±0.11、1.02±0.12、1.13±0.16，均P<0.01；EZH2蛋白：0.23±0.03比1.05±0.13、0.91±0.04、0.81±0.06，均P<0.01），表明采用CRISPR Knockin技术在HEK239T细胞中成功实现了EZH2 mRNA和蛋白表达水平的降低（图4、图5）。
1—对照组；2—转染pUCm-T-VEGF165质粒组；3—转染pSpCas9（BB）-2A-Puro-sgRNA质粒组；4——共转染pUCm-T-VEGF165和pSpCas9（BB）-2A-Puro-sgRNA质粒组;VEGF165—血管内皮生长因子165；sgRNA—小向导RNA。与共转染组比较，aP<0.01
1—对照组；2—转染pUCm-T-VEGF165质粒组；3—转染pSpCas9（BB）-2A-Puro-sgRNA质粒组；4—共转染pUCm-T-VEGF165和pSpCas9（BB）-2A-Puro-sgRNA质粒组；VEGF165—血管内皮生长因子165；sgRNA—小向导RNA。与共转染组比较，aP<0.01
烟雾病也称为Willis环自发性闭塞，是一种慢性、闭塞性脑血管疾病。其临床表现包括短暂性脑缺血发作、缺血性脑卒中、出血性脑卒中、癫痫、头痛、认知功能障碍等，具体临床表现往往与患者年龄有关，但其病因及发病机理尚不清楚。烟雾病的特征常为颈内动脉末端血管闭塞性改变，以及脑底部形成异常的血管网络。东亚国家烟雾病的发病率高于西方国家[9]。文献报道，烟雾病的发病可能与遗传及基因突变具有一定的关系[10]。本研究采用CRISPR knockin技术实现了VEGF165在HEK293T细胞中的定点过表达，为进一步研究VEGF165在烟雾病中的作用提供了研究基础。
VEGF基因由8个外显子和7个内含子构成。通过对VEGF mRNA剪切、修饰可形成不同的亚型。目前已发现9种VEGF A的亚型[11]。VEGF可在正常人和动物的多种组织中低水平表达。脑缺血和颅脑外伤可激活机体的一种内源性防卫机制，诱导VEGF及其受体表达，即VEGF对缺血脑组织具有一定的保护作用[12,13]。VEGF有望成为心血管系统疾病的新治疗靶点。
组蛋白甲基转移酶EZH2具有组蛋白赖氨酸N-甲基转移酶活性，可对组蛋白H3的第27位赖氨酸进行甲基化修饰（H3K27me），进而调节相关基因的表达水平。EZH2在多种类型的肿瘤中呈高表达状态，故被认为是一种原癌基因。在生发中心弥漫性大B细胞淋巴瘤中，EZH2可能发生了Y641和A677点突变[14]。具有Y641及A677点突变的重组EZH2具有更强的H3K27甲基转移酶活性，可显著增加弥漫性大B细胞淋巴瘤中三甲基化H3K27的水平[14,15,16]。然而EZH2在烟雾病病理过程中所起的作用尚不清楚。
本研究采用CRISPR knockin方法将VEGF165基因定点敲入HEK293T细胞中。研究结果表明，该法定点敲入VEGF165基因达到了干扰EZH2 mRNA和蛋白表达的作用，进一步证实了该法实现基因过表达的精准性，避免了采用慢病毒等方法进行过表达而导致的外源基因整合进入染色体的随机性，并可同时实现基因的过表达和基因敲除。本研究建立的CRISPR knockin方法为进一步研究VEGF165和EZH2在烟雾病发病过程中的作用提供了理论基础。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
