初步探讨Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）信号通路在人牙髓干细胞（hDPSCs）成骨向分化中的作用。
采用激光扫描共聚焦技术检测氢氧化钙作用14 d后hDPSCs的细胞骨架变化和经典Wnt信号通路关键启动因子β-catenin的表达及细胞定位。分别上调和抑制Wnt信号通路信号，通过蛋白质印迹（Western Blot）实验和茜素红染色实验检测氢氧化钙作用14 d后hDPSCs的成骨向分化和矿化情况。
氢氧化钙作用效应下hDPSCs的细胞骨架出现结构重排，β-catenin自细胞核内向核外转移。Dickkopf相关蛋白1(DKK-1)阻断Wnt信号通路后，hDPSCs的钙结节数少于单纯氢氧化钙效应细胞；氢氧化钙作用下的hDPSCs表达牙本质涎磷蛋白（DSPP）。
氢氧化钙可下调经典Wnt信号通路的表达，促进hDPSCs的成骨向分化和矿化以及成牙本质向分化。
版权归中华医学会所有。
未经授权，不得转载、摘编本刊文章，不得使用本刊的版式设计。
除非特别声明，本刊刊出的所有文章不代表中华医学会和本刊编委会的观点。
氢氧化钙可作为盖髓剂应用于牙髓治疗，是目前临床最成熟、应用最广泛的盖髓材料。氢氧化钙诱导并加速修复性牙本质的形成是牙髓疾病的治疗基础。研究结果证实，氢氧化钙可减少细胞间液生成，升高组织间Ca2+浓度，通过促进碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）的活性，为组织矿化提供环境[1,2]。Graham等[3]分别采用浓度为0.02 mol/L的氢氧化钙（pH11.7）和体积分数为10%的乙二胺四乙酸（pH7.2）从人牙本质中提取牙本质基质成分（提取时间为14 d），并检测上述2种牙本质提取物中转化生长因子-β1、胶原蛋白-1α和Nestin基因的表达，结果发现转化生长因子-β1在2种牙本质提取物中均呈高表达，进而表明氢氧化钙通过释放生长因子和牙本质生物活性分子参与牙本质桥形成活动。Ji等[4]将含有氢氧化钙的培养基和从比格犬未成熟的牙齿组织中获取的自体牙髓干细胞（dental pulp stem cells，DPSCs）分别共培养7 d和21 d，结果证实氢氧化钙可促进DPSCs的迁移、增殖和矿化。
Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）信号通路被激活后可募集细胞内的β-catenin，将后者活化转移入细胞核，与转录因子T细胞因子/淋巴细胞增强因子（T cell factor/lymphoid enhancer factor，TCF/LEF）等共同作用以激活特异基因的转录。非经典的Wnt信号通路有：细胞极性通路，主要调控细胞骨架的重排；Wnt/Ca2+通路，通过钙依赖性激酶、钙调蛋白和转录因子NF-AT起作用[5]。随着研究的深入，Wnt/β-catenin信号通路在成骨细胞分化和骨量调控中的作用也备受关注。Wnt/β-catenin信号通路作为细胞的成骨启动信号在骨形成早期起着重要作用，可调控未分化间充质细胞向骨系细胞分化，此阶段若条件性敲除β-catenin基因将阻断Wnt/β-catenin信号通路，导致明显的骨骼发育障碍，间充质细胞异常软骨向分化。此外，Wnt/β-catenin信号通路在骨细胞的成熟过程中亦具有重要的调控作用[6]。
DPSCs是牙髓和牙齿再生、组织修复及自体骨改建的种子细胞，在细胞增殖和分化方面受多种因素调控。本研究通过对原代培养的人牙髓干细胞（human dental pulp stem cells，hDPSCs）与氢氧化钙培养基共培养，研究氢氧化钙对hDPSCs增殖、迁移、成骨向分化和矿化的影响和作用；并通过应用信号通路抑制剂阻断Wnt信号通路，探究氢氧化钙效应促进hDPSCs成骨向分化和矿化的作用机制。
兔抗糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β, GSK-3β）单克隆抗体、兔抗磷酸化GSK-3β多克隆抗体（美国Abcam公司），兔抗β-catenin单克隆抗体、兔抗磷酸化β-catenin多克隆抗体（美国Cell Signaling Technology公司），兔抗ALP单克隆抗体、小鼠抗牙本质涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein，DSPP）单克隆抗体（美国Santa Cruz Biotechnology公司），氯化锂（上海碧云天生物技术有限公司），人Dickkopf相关蛋白1（Dickkopf-related protein 1，DKK-1）重组蛋白（美国Peprotech公司），辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔和山羊抗小鼠IgG抗体（武汉博士德生物工程有限公司），超敏ECL化学发光试剂盒（美国Pierce公司），聚偏氟乙烯膜（美国Dupont公司），异硫氰酸荧光素标记的鬼笔环肽（美国Cytoskeleton公司），兔抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH）多克隆抗体（杭州贤至生物科技有限公司）。
Aquelix 5去离子纯水仪（美国Millipore公司），Mini-PROTEAN Tetra 1658001小型垂直电泳槽、PowerPac Basic 1645050基础电泳仪电源（美国Bio-Rad公司），BX53复合光学显微镜（日本Olympus公司），C2激光扫描共聚焦显微镜（日本Nikon公司）。
取原代培养的第3代hDPSCs，待贴壁生长达70%后，吸弃培养基，将细胞分为6组：常规培养基组、氯化锂组、DKK-1组、氢氧化钙培养基组、氯化锂/氢氧化钙培养基组和DKK-1/氢氧化钙培养基组。其中，常规培养基组和氢氧化钙培养基组分别加入含体积分数为10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的α-MEM培养基（常规培养基）和含有质量浓度为10 μg/ml氢氧化钙的无血清α-MEM培养基（氢氧化钙培养基）培养；氯化锂组和DKK-1组分别加入含有质量浓度为100 ng/ml氯化锂或100 ng/ml DKK-1的无血清α-MEM培养基培养1 h后，吸弃培养基，再加入常规培养基培养；氯化锂/氢氧化钙培养基组和DKK-1/氢氧化钙培养基组分别加入含有质量浓度为100 ng/ml氯化锂或100 ng/ml DKK-1的无血清α-MEM培养基培养1 h后，吸弃培养基，再加入氢氧化钙培养基培养。
取原代培养的第3代hDPSCs，经质量浓度为2.5 g/L的胰蛋白酶消化、细胞计数后重悬形成单细胞悬液，接种于6孔板中，用常规培养基进行培养；接种6 h细胞贴壁后吸弃原培养基，按1.2.1节进行分组处理，连续培养14、21 d；收集细胞，冰浴20 min，加入200 μl细胞裂解液，提取蛋白并测定蛋白浓度；将蛋白进行电泳、转膜，根据预染蛋白Marker和目的蛋白相对分子质量的大小，将聚偏氟乙烯膜裁剪成不同的条带；在不同的聚偏氟乙烯膜上分别加入用含吐温20的三羟甲基氨基甲烷缓冲液稀释的一抗兔抗β-catenin单克隆抗体（稀释比例为1∶1 000）、兔抗磷酸化β-catenin多克隆抗体（1∶1 000）、兔抗GSK-3β单克隆抗体（1∶1 000）、兔抗磷酸化GSK-3β多克隆抗体（1∶1 000）、小鼠抗DSPP单克隆抗体（1∶1 000）、兔抗GAPDH多克隆抗体（1∶800）、兔抗ALP单克隆抗体（1∶1 000），4 ℃孵育过夜；加入对应的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔或山羊抗小鼠IgG二抗（1∶600），室温摇床孵育1 h；按照超敏ECL化学发光试剂盒说明书滴加显影液，用ECL增强化学发光仪进行免疫反应条带曝光处理。
取第3代hDPSCs，经质量浓度为2.5 g/L的胰蛋白酶消化、细胞计数后重悬形成单细胞悬液，接种于玻片上，用常规培养基进行培养；接种6 h细胞贴壁后吸弃原培养基，分别加入常规培养基和氢氧化钙培养基，连续培养14 d；收集细胞，依次用体积分数为10%的甲醛固定液固定、体积分数为0.1%的Triton-X 100穿透膜、含质量浓度为50 g/L的牛血清白蛋白封闭过夜；加入一抗兔抗β-catenin单克隆抗体（1∶600），于湿盒中4 ℃孵育过夜；避光加入异硫氰酸荧光素标记的鬼笔环肽（1∶200），于湿盒中37 ℃孵育60 min；滴加4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（终质量浓度为10 μg/ml），避光孵育8 min，对细胞核进行染色；防荧光淬灭剂封片后于激光扫描共聚焦显微镜下采集图像。
取生长良好的第3代hDPSCs接种至6孔板中，待贴壁生长达70%后，按1.2.1节进行分组处理，连续培养14 d；采用体积分数为10%的甲醛固定液固定细胞10 min，蒸馏水冲洗3次；加入含有质量浓度为1 g/L茜素红的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液（pH8.3），37 ℃染色30 min，蒸馏水冲洗；采用光学显微镜进行观察，阳性结果为胞浆内出现红色颗粒。
经典Wnt/β-catenin信号通路会导致β-catenin在细胞质中积累并作为TCF/LEF的转录共激活因子易位至细胞核。本研究采用激光扫描共聚焦技术检测β-catenin的表达及细胞定位，结果如图1所示：hDPSCs经氢氧化钙作用14 d后，β-catenin呈强阳性表达，绿色荧光强度显著增强，同时β-catenin向细胞核外转移，胞质在核周缘聚集形成弹坑状凹陷。
hDPSCs—人牙髓干细胞；GSK-3β—糖原合成酶激酶-3β；β-catenin—β-连环蛋白；GAPDH—甘油醛-3-磷酸脱氢酶；1—常规培养基组；2—氢氧化钙培养基组
采用Western Blot实验检测氢氧化钙作用下hDPSCs中GSK-3β、β-catenin蛋白及其磷酸化蛋白表达变化，结果如图2所示：与常规培养基组相比，氢氧化钙作用14 d后，hDPSCs中β-catenin、磷酸化β-catenin及磷酸化GSK-3β蛋白表达均升高，GSK-3β蛋白表达降低；氢氧化钙作用21 d后，hDPSCs中磷酸化GSK-3β和磷酸化β-catenin蛋白表达较常规培养基组无明显变化，GSK-3β蛋白表达较常规培养基组升高，β-catenin蛋白表达降低。
为研究氢氧化钙对hDPSCs细胞骨架的影响，笔者采用异硫氰酸荧光素标记的鬼笔环肽对细胞骨架进行染色，再用激光扫描共聚焦显微镜进行观察。结果如图3所示，氢氧化钙作用14 d后，hDPSCs红色荧光增强，细胞中间纤维增粗，排列致密并具有一定的方向性，细胞骨架组织规则。
对氢氧化钙作用14 d的hDPSCs进行茜素红染色，以检测氢氧化钙的促成骨作用。结果显示：常规培养基组细胞茜素红染色阴性（图4A）；DKK-1/氢氧化钙培养基组细胞染色出现少许钙结节（图4B）；氢氧化钙培养基组细胞染色的阳性结果和钙结节数明显上调（图4C）。
hDPSCs—人牙髓干细胞；DSSP—牙本质涎磷蛋白；ALP—碱性磷酸酶；GAPDH—甘油醛-3-磷酸脱氢酶；1—常规培养基组；2—氢氧化钙培养基组；3—DKK-1/氢氧化钙培养基组；4—氯化锂/氢氧化钙培养基组；DKK-1—Dickkopf相关蛋白1
分别采用氯化锂激活和DKK-1阻断Wnt信号通路后，对氢氧化钙作用14 d的hDPSCs进行Western Blot实验，以检测成骨向分化标志蛋白ALP和成牙本质向分化标志蛋白DSPP的表达。结果如图5所示，与常规培养基组相比，氢氧化钙培养基组的DSPP和ALP蛋白表达均明显升高；与氢氧化钙培养基组相比，DKK-1/氢氧化钙培养基组的DSPP蛋白表达降低，ALP蛋白表达升高，而氯化锂/氢氧化钙培养基组的ALP蛋白表达降低，未见DSPP蛋白表达。
在牙齿发育过程中，Wnt/β-catenin信号通路的增强会抑制DPSCs向成牙本质样细胞分化[7,8]。Wnt信号通路在DPSCs的成骨分化过程中也发挥着重要作用，其可抑制DPSCs的分化能力。不可逆性牙髓炎状态下的DPSCs在受到某种刺激后，能在体内产生增殖反应，发生定向分化，且不同状态下DPSCs的分化能力存在明显差异[9,10,11]。不同类型的Wnt信号通路分子在干细胞骨向分化过程中的作用亦不同，分泌型经典Wnt信号通路在干细胞早期分化方向上具有重要作用；经典Wnt信号通路的增强可导致干细胞矿化功能受阻，而非经典Wnt信号通路分子Wnt4的表达增强可促进干细胞矿化并修复骨组织缺损。非经典Wnt/Ca2+信号通路可激活钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ（CaMK Ⅱ），进而活化转录生长因子β活化激酶1（TAK-1）-Nemo样激酶；Nemo样激酶可使TCF/LEF磷酸化，阻止β-catenin-TCF/LEF复合体绑定DNA进而抑制β-catenin-TCF/LEF复合体活化基因的转录[12,13]。
本研究中hDPSCs在接受氢氧化钙刺激时，β-catenin蛋白表达明显升高，Wnt信号通路被激活；氢氧化钙介导细胞矿化21 d后，β-catenin蛋白表达受到明显抑制（未见表达），而常规培养基组β-catenin蛋白表达略有升高。结合成骨向分化和矿化实验的结果，笔者认为氢氧化钙通过使β-catenin向细胞核外聚集降低了其在细胞核的表达，使得Wnt/β-catenin信号通路低表达，从而明显促进hDPSCs的成骨向分化和细胞矿化，这在调控成骨细胞分化和骨量调节中具有重要作用。
细胞骨架网络能把效应力从细胞表面经细胞质传播到细胞核，抵抗细胞变形，在力-化信号转导中发挥着重要作用[14]。本研究结果发现，常规培养的hDPSCs呈现出常态自由排列的细胞骨架，氢氧化钙的作用使细胞荧光强度逐渐增强，细胞中间纤维增粗，排列致密并具有一定的方向性，细胞骨架组织规则。笔者认为氢氧化钙效应可导致细胞骨架发生重排，并希望通过对细胞骨架与细胞信号转导现象的更深入研究，了解细胞内部信息传递的规律，揭示细胞骨架在体现细胞生物学特性及功能特性之间的有机联系。
激动剂上调Wnt信号通路后，hDPSCs的成骨矿化能力减弱；抑制剂阻断Wnt信号通路后，hDPSCs的成骨分化能力有所增强。但不管是增强还是抑制Wnt信号，氢氧化钙始终扮演着促成骨的角色。氢氧化钙可促进hDPSCs的成骨向分化和细胞矿化，在骨增量和骨组织形成以及牙髓再生方面具有良好的应用前景；可通过氢氧化钙调控hDPSCs的成骨作用来改变干细胞的分化方向，为更好地解决骨增量的需求问题提供可能。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
