组织工程学是以材料学、生命科学和工程学为一体的综合性学科，通过细胞或组织重建等修复、改善损伤组织或器官并保留其功能。近年来随着组织工程技术的快速发展，组织工程气管逐渐成为气管替代治疗的新途径。但因供应气管的血管纤细且呈阶段性分布，气管移植物无法得到足够的血供来维持其需求，使其血管化问题成为组织工程气管发展的主要障碍之一。在组织工程气管构建中，种子细胞、气管支架及生长因子的血管化策略逐渐成为研究重点。旨在结合目前组织工程气管血管化的相关研究对其进行综述。
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气管损伤主要由肿瘤、创伤、感染等引起，当气管缺损长度小于成人全长的1/2或儿童的1/3时，端端吻合被认为是气管修复的最有效治疗方法[1]。但当缺损超过成人全长的1/2或儿童的1/3时，吻合处的机械张力较高，易导致严重且致命的术后并发症，无法进行直接吻合，此时需要气管替代物进行气管重建[2]。随着组织工程技术在气管研究中的不断进步，组织工程气管逐渐成为气管替代治疗的主要方法之一。由于气管不具有单独的供血动脉及引流静脉，其血供来源于甲状腺和食管周围组织的毛细血管网，因此气管移植的主要障碍之一是在植入后的初始阶段无法得到足够的血液供应来维持组织的生存需要。气管移植物的快速血管化可帮助恢复手术部位的血供，其对组织工程气管至关重要。本文主要通过种子细胞、气管支架和生长因子3方面对组织工程气管血管化进行综述。
种子细胞的研究是组织工程气管的关键研究之一。在组织工程气管支架上整合可分泌血管生长因子的细胞，如内皮细胞、内皮祖细胞（endothelial progenitor cells，EPCs）等，可加快气管移植物血管重建。内皮细胞与壁细胞前体或成纤维细胞共同培养，可诱导新生血管的发育，从而形成毛细血管网[3,4]。这些毛细血管网大大减少了支架与宿主血管系统吻合的时间，与非血管化组织的植入物相比，提高了移植的可行性。EPCs是未成熟内皮细胞的表型，可分化成所有组织的内皮细胞，参与血管的形成，加快血管再生[5]。其可通过受者的周边和脐带静脉血获得，也可通过诱导多能干细胞中获得，以减轻抗原性问题。干细胞具有自我更新能力和多向分化潜能，可分化为内皮细胞、EPCs和软骨细胞等来影响组织工程气管血管化。
间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）来源广泛，易于培养、分离、纯化，多次传代后仍具有强大的增殖能力和多向分化潜能[6]。MSCs具有的诸多优点，使其成为组织工程气管研究中理想的种子细胞来源之一，因此MSCs分化为血管内皮细胞的研究备受关注。
MSCs经特定诱导可向血管内皮细胞分化，为气管移植物构建新生血管，参与运输氧、营养物质和各种生物活动。目前，国内外常使用血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）和内皮细胞生长添加剂等作为诱导分化剂[7]。Li等[8]通过研究C-X-C趋化因子受体2（CXCR2）及其下游信号通路在MSCs诱导EPCs迁移中的作用，发现MSCs可通过激活CXCR2及下游信号通路促进EPCs迁移以及随后的组织工程支架血管化。韩云等[9]使用冻存2周和6周的气管进行大鼠同种异体气管移植，其将PKH-26标记的骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells, BMSCs）经鼠尾静脉移植入受体内，术后1周测定BMSCs移植组气管上皮内的VEGF蛋白表达呈阳性，表明BMSCs能够促进移植物周围新生血管的增加，从而促进气管损伤的修复。目前MSCs在组织工程化气管中应用前景十分理想，但仍有一些问题需要解决，如：寻找更理想的诱导因子；MSCs如何精确定向分化为组织工程气管所需细胞的机制等。
胚胎干细胞（embryonic stem cells, ESC）是指一类起源于胚胎，处于未分化状态，可长期自我分化和更新，具有在一定条件下分化形成各种组织细胞潜能的细胞，这部分未分化细胞在培养为胚状体时可自发分化为3个胚层的组织细胞[10]。James等[11]在ESC分化为内皮细胞过程中，抑制转化生长因子（TGF）使内皮细胞增加到10倍，再通过转化生长因子-β（TGF-β）抑制维持内皮细胞的增殖和血管化特性，使内皮细胞大量扩增，其实验为ESC衍生内皮细胞的分化和长期维持提供了方法。研究结果表明，使用细胞共同培养技术或添加诱导剂，将ESC诱导分化为血管内皮细胞效果显著[12,13]，结合ESC可在体外大量扩增的特征，为解决内皮细胞来源有限的问题提供了较理想的解决方案。
脂肪干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）是具有应用潜力的种子细胞，研究结果已经证实，ADSCs不仅可向不同胚层来源的组织细胞分化，而且将这些细胞与合适的支架材料整合后，可在体内构建不同的组织结构，包括骨、软骨、脂肪和血管组织[14]。刘子琪等[15]利用含有内皮细胞生长因子的培养基诱导ADSCs分化为EPCs，其不仅得到数量较多的EPCs，延长了细胞培养周期，还在一定程度上改善了EPCs培养周期较短及不易分化等缺点，为EPCs在临床上的应用提供了重要的种子细胞来源。Seebach等[16]通过研究EPCs在骨移植血管化中直接和间接的影响，发现EPCs可在植入处直接形成新血管，从而加速了血管的早期形成，且可通过移植的EPCs释放趋化因子来招募宿主的EPCs。Zhang等[17]在体外预血管化过程中将内皮细胞广泛分布于整个气管支架，形成了毛细血管通道，随后将支架植入体内，发现预先建立的血管网络与宿主血管吻合，并在整个组织结构中显示加速的血管浸润。通过诱导多种干细胞分化为内皮细胞和EPCs的途径，可加快气管移植物血管化进程，但其分化方向不定、周期较长等问题仍需进一步解决。
最佳的气管替代物应具有与原生气管相似的解剖结构和化学生物信号系统，新生组织应具有自我修复、重塑、血管化和再生的能力，并对气管移植物无排斥反应[18,19]。目前，组织工程气管血管化过程主要依赖于促进血管形成的内皮细胞和各种生长因子。随着脱细胞支架、静电纺丝及生物打印技术的发展，可通过设计新型支架并结合相应的细胞因子促进组织工程气管血管化。
通过设计新型气管支架来促进血管的长入，可加速血管化的过程。气管支架的理想状态是在支架上形成血管，因此支架材料需与内皮细胞有良好的兼容性并具有大小适度的孔隙以便毛细血管的长入。支架上的孔隙不宜太大或过多，否则会减少细胞附着的面积；支架孔隙也不宜太小，研究结果表明，直径小于100 μm的孔隙可能会阻止氧气和养分进入支架内部，因为细胞有可能会在支架表面聚集并堵塞孔隙[20]。在不考虑支架结构支撑的情况下，较大的平均孔隙和快速的降解使血管形成更快；而由于支架的解体过早而失去结构支撑会导致支架和血管生成的破坏。为解决此问题，Mehdizadeh等[21]研究了多层支架模型的血管化程度，其在每一层中使用不同降解速度的材料，希望可在保持一定支撑作用前提下提高气管支架的血管化。通过与单层模型对比，多层支架模型的血管化得到改善。多层次气管支架的发展使人们对组织工程支架最优几何构建和降解特性的认识更加深入。
脱细胞是在保存细胞外基质的同时，去除组织中具有免疫原性的细胞和核材料，现阶段脱细胞的主要方法是通过洗涤剂和酶来实现的[22]。脱细胞基质可在尽可能不引起免疫反应的情况下，允许细胞生长和功能分化[23]。Sun等[24]采用改良洗涤剂酶切法对新西兰大白兔气管进行脱细胞，组织学和分子生物学分析结果表明，大部分细胞成分和核物质被清除，消除了抗原性；扫描电镜分析结果表明，脱细胞基质保留了原生气管的结构。此技术可产生一个与原生器官相似的支架，进而更好地模拟体内生长环境，是器官功能重建和恢复的关键[25]。
脱细胞气管通过其天然的气管形态和细胞外基质为细胞生长和组织再生提供良好的细胞外基质模板[26,27]。Baiguera等[28]研究结果发现，脱细胞气管可维持VEGF和bFGF的表达。血管生成实验结果显示，脱细胞气管支架可诱导强烈的体内血管生成反应，SEM分析表明，脱细胞基质保留了原生气管的分级结构。因此，脱细胞气管被认为是理想的组织工程气管支架之一，但还有其他问题有待解决，如支架机械强度的丢失、支架制备耗时较长等。
近年来，3D打印技术快速发展，可精确控制支架的形状和细胞分布。Chang等[29]利用3D打印的聚己内酯(polycaprolactone，PCL)支架成功地进行了兔气管的重建。他们将兔股骨和胫骨处获得的BMSCs接种于支架内，移植后发现细胞存活率达83.6%，术后4周气管支架与正常气管融合良好，且气管植入部新生血管与宿主血管吻合。Bae等[30]通过3D生物打印技术制备了一种上皮细胞和MSCs互相兼容的新型支架，该支架分为5层，由PCL构成1、3、5层作为支撑结构，上皮细胞和MSCs分别接种于第2层和第4层，通过原位移植对兔气管进行重建，术后12周行CT及支气管镜检查，吻合口愈合良好，可见新生的毛细血管和上皮细胞。通过3D打印技术设计支架结构和模拟细胞外基质，可很大程度地提高组织工程气管血管化，但支架制备耗费较高、支架的模型构建等问题尚需解决。
静电纺丝作为一种可生产纳米纤维和加工便捷的新型加工技术，通过控制材料的结构，可制造与大多数组织均有高度相似的纤维结构，从而在组织工程领域得到了广泛应用[31,32,33]。研究结果显示，静电纺丝材料可促进脐静脉内皮细胞的黏附和内皮细胞的快速增殖，而增加移植物的血管化程度[32]。Fu等[34]通过裸鼠皮下实验结果表明，聚左旋乳酸-己内酯[poly（L-lactic acid caprolactone），PLCL]制作静电纺丝支架具有较强的机械强度和附着力，可促进内皮细胞增殖，且在支架表面形成较均匀的血管组织。张夏等[35]将大鼠来源的EPCs接种于PLCL/明胶静电纺丝支架上，通过扫面电镜、PCR等发现，支架表面类似天然细胞外基质，有利于细胞黏附，生长因子表达量显著增加，从而促进EPCs成血管化。
气管不具有单独的供血动脉及引流静脉，其血供来源于甲状腺和食管周围组织的毛细血管网。为使气管移植物早期得到充足血供，可在移植前将其植入受体其他部位，如肌肉、大网膜等，一段时间后气管移植物形成新生血管网络。Kim等[36]通过将大网膜包裹的犬气管置于其腹膜腔内进行血管化后再对该犬进行原位移植，发现术后活动正常，2个月后支气管镜检查未见狭窄。Weidenbecher等[37]用兔肌肉皮瓣覆盖气管移植物后进行气管重建，所有移植物均发育为供血良好的气管。Luo等[38]在兔胸骨舌骨肌内植入气管支架，持续4周，已见重新血管化移植物。与植入皮下组织的非血管化支架相比，血管化的移植物促进带纤毛的上皮细胞生成，且可维持移植物的软骨结构。
生长因子是组织工程气管血管化的主要影响因素之一，研究报道，参与血管形成的生长因子主要有VEGF、bFGF和血管生成素等[39,40]。其中VEGF被广泛认为是一种有效的血管生成因子，与早期血管的形成有关，可促进内皮细胞的有丝分裂，调节内皮细胞的增殖、迁移，促进血管生成。Wang等[39]制备了由PCL和明胶纤维组成的纤维支架，通过肝素固定为VEGF提供结合位点，从而能够持续释放VEGF，加速支架血管化。Dashnyam等[41]研究结果表明，在支架上修饰VEGF可促进细胞向成熟的内皮细胞分化，加快血管再生。此外，bFGF亦是目前公认的促血管形成的因子，其能上调VEGF；并且VEGF与bFGF联用可形成共同的信号通路，加快血管生成[42]。
在组织工程气管中，血管化问题是制约其发展的主要因素之一。研究人员始终在寻找促进气管移植物血管再生的方法，并在实验研究中已取得较好的成果，但至今，气管血管化策略还存在许多问题和挑战，如精确的种子细胞诱导和定向分化、气管支架的制备耗时较长、预血管化导致的二次损伤和生长因子的持续生效等。随着组织工程学的不断发展和研究人员的不断实践，这些问题终会被解决，组织工程气管血管化问题也会被完美解决，以加快其在临床中的应用进程。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
