临床上,尿常规检查项目包括尿蛋白、尿酸碱度、尿胆红素等10多项。通常采用干化学方法进行分析,即将尿液浸润多联试剂带后,每联均会发生颜色改变,颜色深浅与该联测定的成分浓度有关,颜色越深,测定的成分浓度越大,反之亦然。介绍了目前临床尿液干化学分析中采用的4种颜色识别技术,分别是基于积分球光电转换的分析技术、基于电荷耦合器件图像传感器的分析技术、基于颜色传感器的分析技术和基于颜色传感器加光纤束的分析技术,并对这4种技术进行了比较分析。最后,对尿液分析的最新进展作了综述。
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尿液分析是医学常规检查项目,用于泌尿系统疾病监测、安全用药监护、职业病和人体健康状态评估等方面,主要包括:①物理检查,如颜色、气味、浊度等。②干化学分析(dry chemical analysis),包括尿酸碱度、尿蛋白、尿糖、尿酮体、尿亚硝酸盐、尿胆红素、尿胆原、尿白细胞、尿潜血、尿比重等10多项检测项目[1,2,3]。③尿沉渣分析,用于对尿液中的红细胞、白细胞、肾小管上皮细胞和管型等有形成分的分析。临床上常采用尿液分析仪对常规检查项目进行干化学分析,尿沉渣分析仪进行有形成分分析。本文重点介绍前者的分析技术及其研究进展。
多联试剂带是将尿液干化学分析的10多项检测项目集成在一条试剂带上,每联均为5 mm×5 mm的正方形,相邻两联之间的间隔为3 mm。每联均采用多层膜块结构,如图1所示[4,5,6]:①第1层为尼龙膜,起保护作用,防止尿液中大分子物质污染反应,保证试剂带的完整性。②第2层为试剂层,在该层尿液与试剂发生化学反应(与所测定项目有关),产生颜色变化(表1)。有些联还会有酸盐层或过碘酸盐层,目的是破坏维生素C的干扰作用,因为维生素C是强还原剂,可干扰试剂与被测定的尿液成分发生氧化还原反应,从而导致假阳性。③第3层为吸水层,使得尿液均匀快速侵入,防止流至相邻联中去。④第4层,即最底层的塑料载体层,起到支撑载体的作用。注意,多联试剂带一般会有空白联,用于颜色补偿,消除尿液本身的颜色。
检测项目 | 检测方法 | 颜色变化 |
---|---|---|
尿酸碱度 | pH指示剂法 | 橙红、黄绿及蓝色 |
尿蛋白 | pH指示剂蛋白误差法 | 黄、绿及蓝色 |
尿糖 | 葡萄糖氧化酶法 | 蓝色、红褐色或红色 |
尿酮体 | 亚硝基铁氰化钠法 | 紫色 |
尿亚硝酸盐 | 偶氮法 | 红色 |
尿胆红素 | 偶氮法 | 红色 |
尿胆原 | 醛化反应法、偶氮法 | 樱红色、胭脂红色 |
尿白细胞 | 中性粒细胞酯酶法 | 靛蓝、紫色 |
尿红细胞 | 过氧化物酶法 | 蓝绿色 |
尿维生素C | 还原法 | 绿或深蓝至粉红色 |
目前临床上使用的多联试剂带有八联、九联和十联等。随着新的干化学分析方法的出现(并伴有颜色变化),将有更多的尿液检测项目被用于多联试剂带。如艾康生物技术(杭州)有限公司生产的多联试剂带可检测14个项目,除上述10个检测项目(尿酸碱度、尿蛋白、尿糖、尿酮体、尿亚硝酸盐、尿胆红素、尿胆原、尿白细胞、尿潜血和尿比重)外,还能检测尿维生素C、尿肌酐、尿钙和尿微量白蛋白。围绕着识别多联试剂带的颜色变化,下文将重点阐述目前临床使用的尿常规检查项目分析技术及其进展[7,8,9,10,11],包括基于积分球光电转换的分析技术、基于电荷耦合器件(charge coupled device,CCD)图像传感器的分析技术、基于颜色传感器的分析技术和基于颜色传感器加光纤束的分析技术。
基于积分球光电转换的分析技术,其核心部件是球面积分仪,即积分球(图2)。积分球是一个空心圆球体,球内壁各点漫反射是均匀的,即积分球内壁反射率是一定的,内壁各处照度大小相等;当入射光照入积分球内,会产生多次漫反射光的照射,总照度可通过积分方式加以计算,故称之为积分球。将浸有尿液的试剂带置于测量窗时,探测器探测到的多次漫反射形成的总照度将会减少,其减少量即为被样本所吸收的量。在此过程中,光源发出的光通过漫反射后照射至试剂带的膜块上,试剂带膜块颜色的深浅对光的吸收和反射是不一样的,试剂带的颜色越深,吸收光量值越大,反射光量值越小,探测器探测到的照度就越小;反之亦然。也就是说,试剂带的颜色深浅与尿液中对应成分的浓度高低成正比。
在实际使用中,光线对于试剂带的反射率可通过下式计算
式中:R为光线对于试剂带的反射率;Tm为试剂块对测定光的反射强度;Ts为试剂块对参考光的反射强度;Cm为标准块或空白块对测定光的反射强度;Cs为标准块或空白块对参考光的反射强度。
尿液分析仪采用双波长单色光检测试剂块的颜色变化,一个波长为测定光,另一个波长为参考光,用于消除背景光和杂散光的影响,同时也提高了测量精度。通常,尿白细胞、尿胆原、尿胆红素、尿酮体和尿亚硝酸盐的测定光波长为550 nm,尿潜血、尿蛋白、尿比重、尿维生素C、尿糖和尿酸碱度的测定光波长为620 nm,各试剂带的参考光波长均为720 nm。
在该分析技术中,光源由能发出3种特定频率的发光二极管(light emitting diode, LED)产生,3种LED依次相间地排成一列,以形成线状光,透过毛玻璃(磨砂玻璃)使光线均匀照射在试剂块上,反射光再经透镜聚焦成像在光学元件CCD上(图3)。测出反射光的光亮值,即可实现对尿液成分含量的检测。经尿液浸润的试剂带膜块,均可被视为只有1种颜色的图像,然后采用CCD图像识别法进行识别[12,13,14,15,16,17]。
在HSI彩色空间模型中,用色调(hue)、饱和度(saturation)和亮度(intensity)来描述色彩。色调是指纯色的颜色特性,基本色调是太阳光分散的七色光;饱和度是指纯色光被白光稀释程度的度量,即颜色的鲜艳程度;亮度是人眼对光强度的感知,表示颜色明暗的程度。而在RGB彩色空间模型中,R(red)代表颜色中红的程度,G(green)代表颜色中绿的程度,B(blue)代表颜色中蓝的程度。RGB(255,0,0)的红色、RGB(0, 255, 0)的绿色和RGB(0,0,255)的蓝色,也称为三原色(three primary colors)。对于任何颜色,均可通过HSI彩色空间模型或RGB彩色空间模型来描述,且这两个空间可以互相转换[18]。
RGB颜色传感器(colorimetric sensor)可通过测量构成物体颜色的三原色的反射率,将反射率转化为脉冲波,再通过输出脉冲波的频率得到待测物质的RGB值。LED发出的光照射至经尿液浸润的试剂带膜块上,并被反射至颜色传感器上,颜色传感器将其转换为RGB值,供中央处理器读取并计算尿液中对应成分的浓度[19,20](图4)。
TCS230和TCS3200是美国TAOS公司推出的2款颜色传感器,其识别颜色的原理为当选定1种颜色滤光片时,其只允许某种特定的原色通过,而阻止其他原色通过。例如,当选择红色滤光片时,入射光中只有红色可通过,蓝色和绿色被阻止,这样就可得到红色光的光强。同理,分别选择蓝色和绿色滤光片,就可得到蓝色光和绿色光的光强。通过这3个值,就可分析出投射到颜色传感器上的光的颜色,即试剂带的颜色,其对应于某个被测项目的浓度值[21,22,23,24,25,26]。
(一)在基于积分球光电转换的分析技术中,对积分球要求较高,如积分球的内表面需为一个完整的几何球面;球内壁需为中性均匀漫射面,且对各种波长的入射光线具有相同的漫反射比。
(二)在基于CCD图像传感器的分析技术中,CCD器件具有良好的光电转换特性,其光谱响应范围囊括了可见光,而试剂带膜块经尿液浸润和化学反应后,呈现的正是可见光。光源通常采用LED,3种能发出特定频率的LED依次相间地排成一列,可形成线状光源,发光效率较高。同时,CCD具有自扫描、灵敏度高、寿命长、功耗低和可靠性高等优点,缺点为CCD光学系统较复杂,对软件算法要求较高,成本也相对较高。此外,该分析技术中所有测试项目的数据可一次性读入,无需逐个试剂带进行读图像操作,大大提高了测试速度。
(三)在基于颜色传感器的分析技术中,设有多个LED光源用于白平衡。颜色传感器的装配位置以及多个LED光源的角度对测试结果有很大影响,这是由于入射光角度不同,会造成颜色传感器感光面接收到的反射光的光强也不同,接收的反射光光强越大,颜色识别误差越小。颜色传感器的测量结果还和传感器与被测试剂带之间的距离有关,测量距离不同,颜色传感器感光面接收到的光强也不同,距离越近,接收的光强越小;若距离较远,可加凸透镜将反射光会聚至颜色传感器的感光面。此外,背景光也对颜色传感器有较大影响:强背景光可使颜色传感器处于饱和状态;对于背景光成分复杂的情况,可采用"暗室"来解决。
(四)在基于颜色传感器加光纤束的分析技术中,光纤具有功耗低、灵活性高、光强损耗低和抗电磁干扰能力强的特点,同时能很好地控制光的传输。光纤的柔韧性也能保证入射光纤和反射光纤均垂直于试剂带的膜块。与基于颜色传感器的分析技术相比,本技术采用光导纤维全反射方式代替了空气传播,大大降低了光的损耗,并减少了强背景光或成分复杂的背景光对尿液试剂带和颜色传感器的影响。此外,由于采用了全反射光纤,光源和颜色传感器与尿液试剂带之间的距离也可以较远而不影响测量结果。
目前,基于CCD图像传感器的分析技术已应用于大型全自动尿液分析仪中,而小型便携式尿液分析仪一般采用基于积分球光电转换的分析技术或基于颜色传感器的分析技术;基于颜色传感器加光纤束的分析技术报道于2018年,尚未见其应用。
无论采用上述哪种分析技术,尿液干化学分析均用到多联试剂带。经尿液浸润后的多联试剂带颜色发生改变,可采用不同方法进行定性或半定量的颜色识别,从而得出被测项目的浓度。
尿液分析最新发展包括:①可用多联试剂带检测更多项目。②流水线操作。随着技术的发展,一些分析仪器对临床诊疗所需的尿液检测项目进行了逐步细化,如德国Bayer公司研发的尿液分析仪把微量白蛋白的检测项目分成了高浓度微量白蛋白和低浓度微量白蛋白两个小项,可用于早期肾病和糖尿病的筛查;德国Siemens公司推出的尿液分析仪利用CCD技术检测荧光免疫信号,可用于测定A族链球菌、幽门螺旋杆菌、单胞菌和衣原体等。尿液分析流水线是利用计算机应用软件将尿液分析仪和尿液有形成分分析仪(尿沉渣分析仪)联合使用,根据多联试剂带的不同,自动分析尿液中的10~14项化学指标,并可增加相应的膜块,自动获得尿液的电导、颜色和浊度;有形成分分析采用机器视觉技术,以自动形态学方法对尿液中的各种管型、结晶体、黏液丝、细胞、精子、滴虫等进行自动识别与分类计数,可用于泌尿系统疾病、肾脏疾病、循环系统疾病和感染性疾病的诊断及鉴别诊断,还可用于临床用药监测、健康普查等常规检查。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突