探讨组蛋白甲基化酶zeste基因增强子同源物2（EZH2）及血管内皮生长因子165（VEGF 165）在烟雾病中的作用。
选取新西兰大耳白兔，采用耳静脉注射马血清的方法建立烟雾病动物模型，并通过包装慢病毒的方法原位过表达VEGF165，采用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法（Western Blot）检测大耳白兔脑组织中VEGF165、EZH2和H3K27me3的表达变化。
与正常对照组相比，烟雾病模型组EZH2的mRNA和蛋白表达水平升高（EZH2 mRNA：P<0.01），组蛋白H3K27me3水平升高；在烟雾病模型中过表达VEGF165后，EZH2的mRNA和蛋白表达水平进一步升高（EZH2 mRNA：P<0.01），组蛋白H3K27me3水平亦升高。
EZH2在烟雾病的发病过程中起到了一定作用，且EZH2的表达受VEGF165的调控，这为烟雾病发病机理的研究提供了理论基础。
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烟雾病（moyamoya disease）是一种主要表现为脑底动脉环（Willis环）前部循环血管狭窄和闭塞的疾病，因脑血管造影时呈现许多密集成堆的小血管影，似吸烟时吐出的烟雾而得名。该病最早于1955年由日本的清水和竹内描述，1966年由铃木命名，在中国、日本以及白种人、黑种人、高加索人中均有发现。由于血管病理性收缩阻碍了正常的血液循环，常在堵塞血管周围生成血管，建立侧支循环。但侧支循环的血管较为细小，容易诱发动脉瘤和血栓的形成。在常规X射线血管造影中，这些侧支血管呈烟雾状。烟雾病主要表现为病变血管的血管内弹力层弯曲、内膜明显增厚、间质萎缩变薄，血管壁上出现脂质沉积及附壁血栓等现象[1]。目前烟雾病的发病原因尚不清楚，可能与遗传和环境因素有关。烟雾病的治疗手段分为内科治疗和手术治疗。发生脑缺血后可进行内科治疗，包括使用皮质激素、阿司匹林、噻氯匹定、钙通道阻滞剂（如尼莫地平）、甘露醇及抗生素等，但治疗效果均不满意。研究烟雾病的发病机制有助于提高临床医生和患者对该疾病的认识，为临床治疗烟雾病提供依据。
表观遗传学是指在DNA碱基序列不发生改变的情况下，基因表达呈现可遗传变化的一门遗传学分支学科，其研究对象包括DNA甲基化或乙酰化修饰、组蛋白甲基化或乙酰化修饰等[2]。表观遗传学对细胞生存与增殖、细胞编程与重编程、器官形成与发育乃至疾病的发生发展至关重要。作为一种表观遗传因子，组蛋白甲基转移酶zeste基因增强子同源物2（enhancer of zeste homolog 2, EZH2）是多梳抑制复合物2中的重要催化亚基，具有组蛋白赖氨酸N-甲基转移酶活性，可对组蛋白H3的第27位赖氨酸进行甲基化修饰（H3K27me），进而抑制相关基因的表达。EZH2在多种肿瘤中呈高表达，其靶基因在肿瘤细胞中被显著抑制，已成为肿瘤研究的热点[3,4,5]。但EZH2在烟雾病中所起的作用尚未见报道。
血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）也称血管通透因子，是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，具有增加血管通透性和细胞外基质变性、促进血管内皮细胞迁移和增殖，以及促进血管形成等作用。VEGF具有5种亚型，根据氨基酸的数目分别命名为VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF189和VEGF206，其中VEGF165为VEGF的主要存在形式，与多种颅内病变的血管生成有关。文献报道，烟雾病患者硬脑膜中的VEGF表达上调[6]；VEGF对于烟雾病患者血管的形成和维持具有重要作用[7]。过表达VEGF有可能会进一步促进血管生成，改善血栓和堵塞症状，这对烟雾病的治疗具有一定的意义。因此，本研究采用新西兰大耳白兔建立烟雾病动物模型，通过包装慢病毒的方法以实现过表达VEGF165。
HEK293T细胞（美国模式培养物集存库），LipofectamineTM 2000、TRIzolTM试剂、RevertAidTM反转录酶（EP0441）、反转录试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific公司），实时荧光定量PCR试剂盒FastStart Universal SYBR Green Master（Rox）（瑞士Roche公司），DNA纯化回收试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]，质粒中提试剂盒（美国Biomiga公司），DH5α感受态细胞、小鼠源β-肌动蛋白（β-actin）单克隆抗体、兔源EZH2单克隆抗体、兔源H3单克隆抗体、兔源H3K27me3单克隆抗体、小鼠源VEGF165单克隆抗体（英国Abcam公司），辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG（H+L）、辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG（H+L）（美国Cell Signaling Technology公司），马血清（美国HyClone公司），ECL化学发光液（美国Millipore公司）。健康无特定病原体级新西兰大耳白兔（CBWR/B）40只，雌雄各半，2~4月龄，体质量范围2.0~3.0 kg，购自北京金牧阳实验动物饲养有限公司，动物使用许可证号SCXK（京）2015-0005。
NanoDropTM 2000分光光度计（美国Thermo Fisher Scientific公司），Tanan 4500全自动化学发光图像分析仪（济南博鑫生物技术有限公司），ECAT EXACT HR+型正电子发射断层扫描仪（PET）（德国Siemens公司），Optima XPN100超速离心机（美国Beckman Coulter公司），ChemiDoc MP全能型凝胶成像分析系统（美国Bio-Rad公司）。
选用新西兰大耳白兔（CBWR/B）40只，2~4月龄，体质量范围2.0~3.0 kg，单笼饲养，每个兔笼均配有饮水饮食设施，室温为20~24 ℃，相对湿度为55%~70%，标准颗粒饲料喂养。雌雄随机选用，分为正常对照组（n=10）和实验组（n=30），动物于实验前适应实验室环境1周。
实验组大耳白兔耳静脉注射马血清12个月，前6个月的注射体积分别为第1个月0.5 ml、第2个月1.5 ml、第3个月3.0 ml、第4个月5.0 ml、第5个月7.0 ml、第6个月9.0 ml，后6个月每月的注射体积均为10.0 ml。前6个月每周注射1次，之后每月注射1次。正常对照组大耳白兔于相同时间段耳静脉注射等体积的生理盐水。
将正常对照组和实验组大耳白兔用高压注射器经颈内动脉置入的微导管注射对比剂碘普罗胺注射液（150 mg/ml），进行数字减影血管造影检查。
选取第3代慢病毒包装体系（pMDLg/pRRE、pRSV-Rev、pMD2.G和pEF1a-VEGF165表达质粒），使用LipofectamineTM 2000将其共转染至HEK293T细胞；48 h后收集培养液上清，经0.45 μm微孔滤膜过滤后，超速离心浓缩慢病毒。
将实验动物分为正常对照组、烟雾病模型组、烟雾病空载慢病毒组和烟雾病慢病毒组，每组10只。其中烟雾病空载慢病毒组和烟雾病慢病毒组注射马血清11个月后，采用脑室内注射方法分别注射空载病毒pEF1a和慢病毒pEF1a-VEGF165。
注射马血清12个月后，取各组大耳白兔的脑组织。采用TRIzolTM试剂提取脑组织总RNA，并用分光光度计测定总RNA浓度。取1 μg总RNA，使用RevertAidTM反转录酶将其反转录为cDNA。以cDNA为模板，采用FastStart Universal SYBR Green Master（Rox）试剂盒进行实时荧光定量PCR。所用引物序列如下：VEGF165正向引物序列5′-AAAACACAG- ACTCGCGTTGC-3′，反向引物序列5′-GCCTCGGCT- TGTCACATCT-3′；EZH2正向引物序列5′-GCTTCC- TACATCGTAAGTGCAA-3′，反向引物序列5′-ATTA- ATGGTGGGGGTGCTGG-3′；β-actin正向引物序列5′-CTGGACTTCGAGCAAGAGAT-3′，反向引物序列5′-GATGTCCACGTCACACTTCA-3′。
手术采集脑组织后取发病位点血管组织，磷酸盐缓冲液洗3次，加入RIPA裂解液，于冰上采用超声破碎仪超声30 min，4 ℃、1 300× g离心20 min；转移上清至新的1.5 ml离心管中，测定蛋白浓度；加入4×上样缓冲液混匀，100 ℃煮沸10 min使蛋白变性。配制10%聚丙烯酰胺凝胶，取20 μg蛋白样品上样，用1×上样缓冲液补齐上样量，80 V电压跑至Marker分开后调整电压为120 V，直至所需条带完全跑开；取下凝胶进行转膜（400 mA，1.5 h），加入质量浓度为50 g/L的牛血清白蛋白，室温封闭1 h；分别加入兔源EZH2（1∶1 000）、H3K27me3（1∶1 000）、H3（1:5000）单克隆抗体，以及小鼠源VEGF165（1∶5 000）、β-actin（1∶3 000）单克隆抗体，4 ℃孵育过夜，用含体积分数为0.05%吐温20的三羟甲基氨基甲烷缓冲液洗3次，每次10 min；分别加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔和山羊抗小鼠IgG（H+L）（均1∶3 000），室温孵育1 h，用含体积分数为0.05%吐温20的三羟甲基氨基甲烷缓冲液洗3次，每次10 min；ECL化学发光液显色，全能型凝胶成像分析系统记录结果。
采用SPSS19.0统计学软件处理数据，符合正态分布的计量资料以均值±标准差（Mean±SD）表示，样本间两两比较采用t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。
由图1可知，新西兰大耳白兔耳静脉注射马血清6个月后颅内动脉呈节段性狭窄（图1B），注射马血清12个月后颅内血管呈烟雾状（图1C），表明烟雾病模型建立成功。
由图2可知，采用脑室内注射的方法注射慢病毒pEF1a-VEGF165后，大耳白兔颅内脑组织中VEGF165的mRNA和蛋白表达水平明显高于烟雾病空载慢病毒组（VEGF165 mRNA：P<0.01），表明VEGF165过表达成功。
1—烟雾病空载慢病毒（pEF1a）组；2—烟雾病慢病毒（pEF1a-VEGF165）组；VEGF165—血管内皮生长因子165；β-actin—β-肌动蛋白。与烟雾病空载慢病毒组比较，aP<0.01
由图3可知，与正常对照组相比，烟雾病模型组组蛋白甲基化酶EZH2的mRNA和蛋白表达水平升高（EZH2 mRNA：P<0.01），组蛋白H3K27me3水平升高；在烟雾病模型中过表达VEGF165后，EZH2的mRNA和蛋白表达水平进一步升高（EZH2 mRNA：P<0.01），组蛋白H3K27me3水平亦升高。
1—正常对照组；2—烟雾病模型组；3—烟雾病空载慢病毒（pEF1a）组；4—烟雾病慢病毒（pEF1a-VEGF165）组；EZH2—zeste基因增强子同源物2；VEGF165—血管内皮生长因子165；β-actin—β-肌动蛋白。与正常对照组比较，aP<0.01；与烟雾病慢病毒组比较，bP<0.01
烟雾病也称为Willis环自发性闭塞，是一种慢性、闭塞性脑血管疾病，其病因尚不清楚。烟雾病的特征常为颈内动脉末端血管闭塞性改变，以及脑底部异常血管网络的形成。东亚国家烟雾病的发病率要高于西方国家[8]。该病的临床表现包括短暂性脑缺血发作、缺血性脑卒中、出血性脑卒中、癫痫、头痛和认知功能障碍等，且具体临床表现往往与患者年龄有关。病理改变主要表现为病变血管的血管内膜明显增厚，内弹力层弯曲，间质萎缩变薄，血管壁上出现附壁血栓及脂质沉积等现象。成人烟雾病颅内狭窄段血管表现为内膜增厚、内弹力层不规则扭曲和折叠、中层平滑肌变薄或缺失，这些血管的远端血管则出现管腔塌陷和类似的内弹力层和中层改变。关于烟雾状新生血管，有些学者认为是原本就存在于颅内并代偿性开放的血管（穹隆部位），表现为薄壁扩张的、或因新近微血栓形成或管壁增厚而闭塞的小动脉，伴或不伴弹性组织变性和纤维化[9]。文献报道，烟雾病的发病可能与遗传以及基因突变具有一定的关系[1]。本研究采用新西兰大耳白兔耳静脉注射马血清的方法，成功建立了烟雾病动物模型。
EZH2在多种肿瘤中呈高表达，其靶基因在肿瘤细胞中被显著抑制，因而EZH2被认为是一种"癌基因"[10]。在生发中心弥漫性大B细胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphomas, DLBCLs）中，EZH2可能发生了Y641和A677位的点突变[11]。携带Y641及A677点突变的重组EZH2具有更强的H3K27甲基转移酶活性，可显著提高DLBCLs中的H3K27me3水平[11,12,13]。EZH2选择性抑制剂可诱导恶性横纹肌样瘤细胞的凋亡和分化，对移植横纹肌样肿瘤的小鼠使用EZH2选择性抑制剂，可使肿瘤体积减小[14]。但EZH2在烟雾病病理过程中所起的作用，目前尚不清楚。
本研究结果表明：与正常对照组相比，烟雾病模型组组蛋白甲基化酶EZH2的mRNA和蛋白表达水平升高，组蛋白H3K27me3水平升高；在烟雾病模型中过表达VEGF165后，EZH2的mRNA和蛋白表达水平进一步升高，组蛋白H3K27me3水平亦升高，提示EZH2在烟雾病的发病过程中起到了一定作用，且EZH2的表达受VEGF165的调控，但其具体机制尚不清楚，需要进一步研究。本研究为烟雾病发病机理的研究提供了理论基础。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
