研究IL-21在初发SLE患者中的表达、来源及与IL-17的相关性。
收集36例初发SLE患者和28名健康对照外周血标本，分离PBMCs及血清。流式细胞术检测PBMCs中CD4+ IL-21+、 CD4+IL-17+细胞比例；荧光定量PCR检测IL-21相关转录调节因子信号转导与转录激活因子3 (STAT3） mRNA基因表达；ELISA检测SLE患者治疗前后血清IL-21水平；磁珠分选初治SLE患者CD4+细胞，流式细胞术分选出CD4+CD25+细胞，检测IL-21在各T辅助细胞亚群Th1 (CD4+IFN-γ+）、Th2 （CD4+IL-4+）、Th17 （CD4+IL-17+）、滤泡T辅助细胞Tfh (CD4+CXCR5+）以及调节性T细胞（CD4+CD25+）上的表达。采用t检验和Pearson相关分析进行统计学分析。
① SLE患者外周血CD4+T细胞的IL-21表达水平[（10.0± 5.9）%]显著高于健康对照[（4.4±1.8）%]（t=4.87，P<0.01），且重型SLE [（14.3±5.4 ）%]显著高于轻型[（6.4± 2.9）%]（t=4.90，P<0.01）；② SLE患者血清IL-21水平[（317±27）pg/ml]较健康对照[（111±12）pg/ml]显著升高（t=5.60 ，P<0.01），治疗后IL-21水平[（266±35）pg/ml]显著下降（t=11.6，P<0.01）；③ SLE患者PBMCs中STAT3 mRNA水平（0.52±0.25）较健康对照组（0.32±0.12）显著上调（t=2.39 ，P<0.05）；④ Th1、Th2、Th17、 Tfh及调节性T细胞均可分泌IL-21；⑤ IL-21水平与SLEDAI评分、抗dsDNA抗体滴度及血清IgG呈正相关（r=0.634 ，P<0.01 ；r=0.408 ，P<0.05 ；r=0.585 ，P<0.01），与补体C3呈负相关（r=-0.554 ，P<0.05）；⑥ SLE患者外周血CD4+ T细胞的IL-17表达水平及血清IL-17水平显著高于健康对照[（1.7±0.7）％和（1.0±0.5 ）% ，t= 3.04 ，P=0.006；（62±26）pg/ml和（41±15）pg/ml，t=2.92，P=0.015]，IL-21与IL-17水平呈正相关（r=0.488 ，P= 0.029）。
SLE患者IL-21在SLE患者CD4+ T细胞表达异常升高，由调节性T细胞及多种Th细胞分泌，与IL-17密切相关，共同参与SLE的发病。
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SLE是一种复杂多变的自身免疫病，其具体病因尚未清楚，但已有许多研究证实T、B细胞的功能异常及细胞因子失调在SLE的发病机制中发挥着重要作用。IL-21是γ链（γc）家族的新成员，其特异转录因子是信号转导与转录激活因子3 （signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）。IL-21在T细胞介导的体液免疫应答、B细胞分化为浆细胞以及自身抗体的产生中起至关重要的作用。目前研究显示辅助性T细胞（Th) 17细胞参与SLE的发病，主要分泌IL-17族细胞因子。本研究旨在探讨IL-21在初发SLE患者中的表达、来源和意义，以及与IL-17的相关性，为认识SLE的发病机制及寻找新的治疗靶点提供理论依据。
选取2009年3月至2010年3月间在北京协和医院风湿免疫科门诊就诊的SLE患者36例，其中男性4例，女性32例，患者年龄16~ 52岁，平均（35±9）岁，病程1个月至4年，病程的为6 (2.6, 12）个月，所有入选患者均未经糖皮质激素及免疫抑制剂等治疗，诊断均符合1997年修订的ACR分类标准。并对患者进行SLEDAI评分和病情轻重评估，其中轻型（临床稳定且无明显内脏损害，SLEDAI<10分）15例，重型（累及重要脏器且SLEDAI评分≥10分）21例，所有患者均收集详细临床资料及进行SLEDAI评分。健康对照28名，均来自北京协和医院健康志愿献血者中分层随机抽取，男性3名，女性25名，年龄21~ 50岁，平均（32±8）岁，相互间及与患者之间无血缘关系，与SLE组在年龄、性别上有可比性（P>0.05）。研究方案获得北京协和医院医学伦理委员会批准（批准号：S-197）。标本采集均在取得受试者知情同意后完成。
FITC标记的小鼠抗人CD4单抗、藻红蛋白（PE）标记的小鼠抗人IL-21、IL-4、IL-17和CD25单抗均购自eBioscience公司，异藻蓝蛋白（APC）标记的小鼠抗人CD4单抗购自Beckman Coulter公司，Alexa Fluor®647标记的小鼠抗人IL-21单抗、Alexa Fluor®488标记的大鼠抗人CXCR5单抗和藻红蛋白标记的小鼠抗人IFN-γ单抗购自BD公司，人CD4磁珠购自德国Miltenyi Biotec公司，豆蔻酰佛波醇乙酯（PMA）和离子霉素钙盐（Ionomycin）购自美国Sigma公司，高尔基抑制剂（Gogiplug）购自BD公司，IL-21 ELISA试剂盒购自R&D公司，总RNA提取液Trizol试剂购自美国Invitrogen公司，荧光定量PCR试剂盒和反转录试剂盒均购自日本Takara公司，引物由北京奥科生物技术有限公司合成。流式细胞仪型BD FACSCantoTM Ⅱ购自BD公司，带分选功能的流式细胞仪型Moflo购自美国Cytomation公司。iQ-5实时荧光定量PCR仪购自美国Bio-rad公司。
无添加剂真空采血管采集初治SLE患者治疗前和治疗后1个月的静脉血2 ml，分离血清无菌分装冻存。用肝素钠抗凝管采集静脉血10 ml，梯度密度离心法分离获得PBMCs。部分PBMCs洗涤后离心去上清，加入总RNA提取液（Trizol ），-80 ℃冻存备用。
采集4例初治SLE患者外周静脉血20 ml，分离PBMCs按每107个细胞加入20 μl CD4-FITC抗体，混合均匀后4 ℃避光孵育30 min，洗涤，每107个细胞加入20 μl的磁珠，混合均匀后，4 ℃避光孵育15 min，洗涤后将细胞悬液加至分离柱中，待其缓慢通过分离柱，用缓冲液冲洗出分离柱内的CD4+细胞待用。取约1×106的CD4+细胞置入新的无菌2 ml EP管，洗涤，加入10 μl CD25-PE抗体，混匀4 ℃避光孵育30 min；洗涤，立即使用流式细胞仪分选出CD4+CD25+细胞群。
无菌分离的PBMCs、CD4+细胞或CD4+CD25+细胞按每孔1×106细胞数种于24孔细胞培养板，追加完全培养基至1 ml培养体系，加入PMA工作液5 μl及离子霉素钙盐工作液7.5 μl，终浓度为50 ng/ml及750 ng/ml，设置复孔，置于37 ℃的5%CO2孵箱孵育；1 h后加入高尔基抑制剂1 μl，孵育4 h后收获细胞，洗涤去上清，设置样本管及同型对照管，加入相应表面标记的荧光抗体（CD4-APC或CD4-FITC、CXCR5-APC）及同型对照20 μl, 4 ℃避光孵育30 min，固定／破膜，加入相应的胞内细胞因子的荧光抗体及同型对照20 μl (IL-21、IL-17、IL-4或IFN-γ），4 ℃避光孵育20 min，2％多聚甲醛溶液200 μl固定，48 h内上机检测。用美国BD公司流式细胞仪检测，原始数据采用FCS Express软件进行分析。
Trizol法提取总RNA，按说明书严格操作，将总RNA反转录为cDNA，后进行荧光定量PCR检测，管家基因采用GAPDH为内参照。STAT3正向引物：5' -GAAGGAGGCGTCACTTTCAC-3'，反向引物：5'-C-TGCTGCTTTGTGTATGGTTC-3'，扩增产物86 bp； GAPDH的正向引物：5'-TCGGAGTCAACGGATTTG-GTC-3'，反向引物：5'-GCCATGGGTGGAATCATATT-GG-3'，扩增产物为105 bp（所设计的引物均由北京奥科生物技术有限公司负责合成），反应条件：95 ℃ 10 s （95 ℃ 5 s；60 ℃ 20 s）×40个循环，95 ℃ 15 s， 96.5 ℃ 15 s, 95 ℃ 15 s, 4 ℃终止反应。采用Bio-Rad iQ5 Optical System Software进行荧光定量操作及数据分析。每份标本以目的基因和内参基因各重复3孔，求出目标基因3个复孔循环阈值（cycle threshold， Ct）的平均值和内参基因3个复孔Ct值的平均值，按2-ΔΔCT公式计算，结果作为评价目标基因表达水平的指标。
按照R&D公司试剂盒说明书严格操作，检测血清IL-21的水平。
采用SPSS 16.0软件包进行统计学处理，正态分布的计量资料用
±s表示，两组间均数比较采用独立样本t检验或配对t检验，相关分析采用Pearson相关分析；以P<0.05为差异有统计学意义。
初治SLE患者外周血CD4+ T细胞中IL-21的表达水平[ （10.0 ± 5.9）%]较健康对照[（4.4 ± 1.8）%]显著增高（t=4.87，P<0.01），重型SLE [（14.3±5.4）%]显著高于轻型SLE [（6.4±2.9）%] （t=4.90，P<0.01）。初治SLE患者血清IL-21水平[（317±27）pg/ml]较健康对照[（111±12）pg/ml]显著增高（t=5.60，P<0.01），治疗1个月后患者复诊，收集其血清，检测IL-21水平[（266±35）pg/ml]显著下降（t=11.6，P<0.01）。
SLE患者外周血PBMCs中STAT3 mRNA水平（0.52 ± 0.25）较健康对照（0.32 ± 0.12）显著升高（t=2.39 ，P<0.05）。
IFN-γ、IL-4、IL-17分别是T辅助细胞Th1、Th2、Th17细胞所产生的代表性细胞因子，持续表达CXCR5是滤泡辅助性T细胞（Tfh）膜表面标志的重要特征，而调节性T细胞是CD4+CD25+ T细胞亚群。因此我们将4例SLE患者外周血CD4+ T细胞以及CD4+CD25+细胞在体外用PMA/Inno进行刺激培养，对各T辅助细胞亚型具有标记性的表面分子及细胞因子进行流式荧光染色，流式细胞术检测，发现IL-21在Th1 （CD4+IFN-γ+）、Th2 (CD4+IL-4+）、 Th17 (CD4+IL-17+）、Tfh (CD4+CXCR5+）以及调节性T细胞（CD4+CD25+）中均有表达（见图1）。
SLE患者IL-21在CD4 + T细胞中的表达率与抗dsDNA抗体滴度、SLEDAI评分以及血清IgG水平呈正相关（r= 0.634，P<0.01；r=0.408，P<0.05；r＝0.585 ，P<0.01），与血清补体C3水平呈负相关（r=-0.554 ，P<0.05）。
SLE患者表达CD4+IL-17+的Th17细胞比例及血清IL-17水平显著高于健康对照[（1.7±0.7）％和（1.0±0.5）%，t=3.04，P=0.006; (62± 26）pg/ml和（41±15）pg/ml ，t=2.92 ，P=0.015 ]，治疗后1个月血清IL-17水平下降，但差异无统计学意义[（62 ± 26）pg/ml和（46 ± 21）pg/ml，t=-7.99，P> 0.05]。SLE患者外周血CD4+T细胞的IL-17表达水平与IL-21表达水平呈正相关（r=0.488 ，P=0.029 ），治疗后血清IL-17水平与IL-21水平无相关性（r=-6.85 ，P>0.05）。
IL-21是属于γ链家族的一种多效性细胞因子，主要功能是促使B细胞活化与分化，分泌免疫球蛋白[1]，并促进Tfh细胞和Th17细胞的分化[2]。在MRL-Faslpr狼疮易感鼠使用IL-21受体融合蛋白后，体内抗体滴度和总IgG水平下降，蛋白尿、皮肤损伤等均有好转[3]，推测IL-21在SLE的发病机制中起着重要作用。
研究发现IL-21在SLE中呈高水平表达[4,5]，也有学者发现SLE患者血清IL-21水平明显下调[6]。对于IL-21水平与疾病活动度是否相关的研究结果也不一致，部分研究认为IL-21水平与疾病活动不相关[4,7]。我们纳入未经激素及免疫抑制剂治疗的初治SLE患者进行研究，发现这些患者CD4+IL21+细胞数及血清IL-21水平均明显升高，这结果与大部分现有的研究结果一致，而且我们发现在有明显脏器受累如LN的重型SLE患者中IL-21水平升高更为显著，进一步分析发现IL-21水平与SLEDAI评分、抗dsDNA抗体滴度呈正相关，与补体C3水平呈负相关，这些结果提示IL-21与SLE疾病活动度密切相关，可作为评估SLE疾病活动和病情轻重的客观指标，IL-21可能参与了脏器损害的发病机制，其升高预示患者脏器受累的风险。经糖皮质激素和免疫抑制剂治疗1个月后，伴随病情的好转血清IL-21水平显著下降，说明IL-21也是评估药物治疗效果的敏感指标。
IL-21可迅速诱导人类所有成熟B细胞亚型分化为免疫球蛋白分泌细胞（ISC），分泌大量免疫球蛋白（Ig) G、IgM和IgA[8]。IgG主要是由浆细胞合成和分泌，我们发现SLE患者IL-21水平与血清IgG呈正相关，证实IL-21与浆细胞的合成分泌能力密切相关， IL-21可能参与了浆细胞分化成熟和分泌抗体的重要过程。
IL-21是由活化的CD4+ T细胞分泌，进一步研究发现Th17、Tfh以及NKT细胞均可以分泌，有学者认为Tfh细胞是IL-21的主要来源细胞[9]。但Dolff等[10]发现SLE患者Th17细胞并不分泌IL-21。为了解IL-21在SLE患者体内是由哪些T细胞所分泌，我们利用各细胞亚群的生物学标记及IL-21进行荧光染色通过流式细胞仪检测，发现SLE患者中不仅Tfh、Th17细胞，Th1、Th2以及调节性T细胞均可分泌IL-21，说明在SLE患者中IL-21的来源是多途径的，Tfh细胞并不是IL-21的主要来源，而调节性T细胞及Th1细胞似乎能分泌更多的IL-21，虽然本研究所纳入的样本少并不能下结论，但能提示在SLE中IL-21不但与B细胞功能相关，与T细胞也密切相关。
Tfh细胞是B细胞最重要的辅助细胞。IL-21可促使原始CD4+ T细胞表达CXCR5而向Tfh细胞分化，减少Tfh细胞凋亡，因此在SLE中Tfh细胞分泌IL-21是一种自分泌并正反馈调控不断放大的过程[11]。目前并无在SLE中Th1、Th2及调节性T细胞是否分泌IL-21的研究报道，但在炎症性肠病的研究中发现分泌IFN-γ的细胞是IL-21的主要来源细胞[12]。正常情况下Th1/Th2可自身促进及相互抑制，通过相互负反馈调节作用保持相对平衡，而活动期SLE存在Th1/Th2细胞平衡失调，Th1细胞功能下调而Th2功能亢进。我们所发现的SLE患者Th1细胞分泌较多IL-21，可能与IL-21负反馈抑制IFN-γ的产生，进而抑制Th1细胞的分化[13]，使Th1/Th2平衡向Th2漂移，同时增强Th2细胞的应答[14]有关。调节性T细胞与Th17细胞也存在一个此消彼长的平衡，普遍认为在SLE中调节性T细胞减少且功能存在缺陷，而Th17细胞明显增多，这也与本研究结果相符。IL-21负向调节调节性T细胞的分化，但可以促使Th17细胞分化与增殖。本研究发现调节性T细胞和Th17细胞均分泌IL-21，调节性T细胞分泌IL-21较多，提示在SLE患者中IL-21可以自分泌而负反馈的形式抑制调节性T细胞，同时以自分泌和旁分泌的形式促使Th17细胞的分化，从而导致调节性T细胞和Th17细胞的平衡失调，促使SLE的发病[15]。
IL-17在SLE发病机制中起重要作用[16]，我们发现在SLE患者中IL-17与IL-21呈正相关，这与Dolff等[10]的研究结果一致。IL-21可通过STAT3转录因子诱导CD4+ T细胞向Th17分化，STAT3是IL-21最主要的转录因子，STAT3功能亢进时RORγt的表达增加，促进Th17细胞的增殖[17]，我们发现SLE患者体内STAT3 mRNA水平显著升高，提示SLE患者体内IL-21通过STAT3转录诱导Th17分化及增殖[18]。经激素及免疫抑制剂治疗后的SLE患者体内IL-21显著下降，IL-17也有下降趋势，但相关性消失，其原因可能是所纳入的样本量不够大，也可能是激素及免疫抑制剂阻断了它们的联合致病作用，同时也能说明IL-21对治疗效果的监测比IL-17更优。
综上所述，SLE患者IL-21水平明显升高，由调节性T细胞及多种Th细胞亚群分泌，与IL-17呈正相关，与SLE发病、活动度和病情轻重密切相关。由于IL-21与IL-17和B细胞分化之间的密切关系，推测阻断IL-21及IL-17可能从多个环节阻断SLE患者B细胞的异常活化与辅助性T细胞亚群的失衡，可作为治疗SLE的新靶点。
