嗜铬细胞瘤/副神经节瘤(pheochromocytoma/paraganglioma, PPGL)是一种罕见的起源于嗜铬组织的神经内分泌源性肿瘤，临床表现为阵发性或持续性高血压，可伴头痛、心悸、出汗三联征；亦有部分患者仅表现为占位效应，无特征性的临床表现。嗜铬细胞瘤起源于肾上腺髓质，约占PPGL的80%～90%；副神经节瘤位于肾上腺外，起源于交感神经链和副交感神经节，只占PPGL的10%～20%。目前已经发现的PPGL致病基因至少有17种，包括RET、VHL、SDHB、SDHD、SDHC、SDHAF2、SDHA、NF1、HIF2A、MAX等，约一半的PPGL发生与上述基因突变有关；其中SDHB基因突变约占总突变率的10%，且超过40%的恶性PPGL的发病与SDHB的基因突变有关^[1,2]。琥珀酸脱氢酶复合物B(Succinate dehydrogenase complex subunit B, SDHB)基因(NM-003000)定位于1p35-p36，全长约40 kb，共8个外显子，编码含280个氨基酸的铁硫蛋白，是线粒体复合酶Ⅱ的重要组成部分。线粒体复合酶Ⅱ是三羧酸循环和有氧电子传递呼吸链中的关键酶之一，包含A、B、C、D 4个亚基，亚基A(succinate dehydrogenase complex A, SDHA)和亚基B(SDHB)形成酶接触中心，亚基C(succinate dehydrogenase complex C, SDHC)与亚基D(succinate dehydrogenase complex D, SDHD)则将该复合体锚定于线粒体内膜上，共同完成电子的传递功能。目前研究认为SDHB基因是一种抑癌基因，当SDHB基因发生杂合突变时，肿瘤组织可发生该基因的杂合性缺失，从而导致SDHB亚基失活，失去对肿瘤细胞的抑制作用；同时SDHB基因突变可导致线粒体的电子传递链活性完全丧失，琥珀酸堆积、低氧诱导因子HIF2α表达增加和血管内皮生长因子表达增加等机制共同促进PPGL的形成^[3,4]，但是PPGL的具体发生机制尚不清。本文报道1例合并SDHB基因新发剪接杂合突变的PPGL，并通过RT-PCR及cDNA测序探究突变后mRNA结构序列的改变和致病机制。

患者，女，17岁，体型消瘦(体重指数16 kg/m²)，阵发性头痛、出汗、心慌4年余，伴面色苍白、乏力、腹泻2～3次/d，无恶心、呕吐、晕厥，持续数分钟至半小时不等，每天约发作2～3次，可自行缓解。1周前发作时测血压160/120 mmHg(1 mmHg＝0.133 kPa)，心率130次/min[未发作状态下测血压波动于(80～90)/(60～70) mmHg，心率波动于(90～100)次/min]。体格检查：发育正常，粗测听力、视力均正常，全身皮肤黏膜无皮疹、色素沉着，甲状腺未触及结节，腹平坦，双下肢无水肿，四肢运功正常，无异常病理征及感觉异常。生化检查：发作时外院测24 h尿肾上腺素26.03 μg/d(正常参考范围0～20，下同)、24 h尿去甲肾上腺素>1 000 μg/d(0～90)，静息状态下我院测24 h尿肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺、香草苦杏仁酸分别为246 μg/d(0～20)、293 μg/d(0～50)、254 μg/d(0～500)、69.00 μmol/d(17～85)；ACTH 8∶00、16∶00、0∶00分别为13.9 pg/ml(7.0～61.1)、5.46 pg/ml、<5 pg/ml；皮质醇8∶00、16∶00、0∶00分别为11.3 μg/dl(7～27)、4.86 μg/dl、2.94 μg/dl，24 h尿游离皮质醇259 nmol/d(73～372)；甲状腺功能FT₃ 5.36 pmol/L(3.28～6.47)、FT₄ 9.81 pmol/L(7.9～18.4)、TSH 1.76 mIU/L(0.34～5.6)；生长激素1.33 ng/ml(0.06～5)、胰岛素样生长因子244.60 ng/mL(193～731)；立位肾素活性测定、醛固酮分别为27.5 ng·ml^－1·h^－1(0.1～6.56)、572.8 pg/ml(70～300)，卧位肾素活性测定、醛固酮分别为24.55 ng·ml^－1·h^－1(0.15～2.33)、327 pg/ml(30～160)，24 h尿醛固酮10.2 μg/d(1～8)；降钙素<2 pg/ml(0～11.5)、甲状旁腺激素30.01 pg/ml、胃泌素-17 1.03 pmol/L(1～15)，空腹血糖7.4 mmol/L；电解质、肝功能、肾功能、血常规均正常。影像学检查：肾血管超声、肾脏超声及甲状腺彩超未见明显异常，全腹部增强CT示右侧腹膜后腰椎3、4水平软组织肿块影，最大截面积58 mm×57 mm，明显强化，中心可见小片无强化低密度，部分层面与下腔静脉分界欠清，十二指肠受压，双侧肾上腺未见异常，¹³¹I-MIBG显像示腹膜后巨大软组织肿块，24 h和48 h放射分布异常浓聚，最大截面62 mm×27 mm，密度欠均匀，可见少量片状低密度坏死区，双侧肾上腺及其他部位未见异常浓聚。

诊断治疗及随访：患者阵发性高血压，伴典型的三联征，发作时尿去甲肾上腺素、肾上腺素明显升高，CT及¹³¹I-MIBG提示为嗜铬细胞瘤，并排除肾血管狭窄、肾素瘤、醛固酮瘤、库欣病等继发性高血压的原因，诊断为下腔静脉旁副神经节瘤，术前予多沙唑嗪缓释片，由4 mg bid逐渐增加至8 mg bid、琥珀酸美托洛尔缓释片，47.5 mg qd"口服2周和扩容，血压控制于110/65 mmHg左右，心率80～90次/min，转泌尿外科行达·芬奇机械臂辅助腹腔镜下副神经节瘤切除术，术前1 d停用降压药物。术中见右侧肾门下肿物，大小约10 cm×8 cm，表面血管怒张，压迫下腔静脉，与髂总动脉关系密切。术后6 h血压90/50 mmHg，患者无特殊不适，腹腔引流出淡红色液体约50 ml，术中出血量约100 ml，术后血红蛋白70 g/L(术前血红蛋白123 g/L)，泌尿外科考虑术中出血、术后引流及术后儿茶酚胺类激素水平下降导致，予积极输注悬浮红细胞4 U、补液治疗后患者血压持续正常稳定。术后病理诊断为嗜铬细胞瘤。1个月后复查血压105/65 mmHg ，24 h尿肾上腺素16 μg/d、去甲肾上腺素38 μg/d，均在正常范围，血糖、电解质均正常，复查¹³¹I-MIBG显像阴性，提示肿瘤完整切除。

经家属和患者同意，获取患者肿瘤组织和外周血行基因检测。第一步肿瘤组织DNA提取与测序：使用Omega Tissue DNA Kit(Omega BiotekD3396-02)提取组织DNA，然后进行PCR扩增，由上海韦翰斯生物医药科技有限公司靶向富集内分泌代谢遗传病相关的1 500个基因的外显子及毗邻剪接区域，并进行高通量测序；第二步Sanger测序在肿瘤组织和外周血进行验证：采用天根血液基因组DNA提取试剂盒(TIANamp Blood DNA Kit, #DP348-03)提取患者外周血DNA，参考SDHB基因序列(OMIM-003000)，运用Primer3Plus软件设计第4外显子引物序列(表1)，并通过NCBI Primer-BLAST进行验证引物特异性，然后进行PCR扩增，PCR产物纯化后在ABI3730基因测序仪上对产物进行单向测序；第三步通过RT-PCR方法对肿瘤组织目的mRNA片段进行反转录、扩增及测序：使用试剂TRlzolOR Reagent(Ambion，15596026)提取患者组织样本及对照组织样本mRNA，使用试剂盒HifairTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(gDNA digester plus)(Yeason Biotech，11121ES50)将mRNA反转录为cDNA，设计引物(表1)，然后进行PCR扩增和测序。

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表1

SDHB基因第4外显子测序引物

表1

SDHB基因第4外显子测序引物

Exon4	引物序列
	正向	反向
DNA	5′-TCAGGCATCTGTGGCTCTT-3′	5′-TCTGTGCCCCATTATTCTCA-3′
cDNA	5′-CGATGGGACCCAGACAAG-3′	5′-TCTCCGTTCCACCAGTAGC-3′

基因测序结果：通过患者肿瘤组织基因组高通量测序发现SDHB基因第4内含子处发生杂合突变：c.423＋1G>T；经Sanger测序该验证该突变存在于肿瘤组织和外周血中，对照组未发现该突变。通过RT-PCR技术将mRNA反转录成cDNA，扩增目的cDNA片段，电泳结果显示患者目的cDNA片段有2条带，较正常对照多了1条缩短带。cDNA测序结果显示患者cDNA序列在剪切位点上游缺失54个编码碱基，即该突变导致SDHB基因第4外显子下游54个编码碱基在转录时被异常剪切，导致编码后的SDHB丢失第124～141位的18个氨基酸，预测该突变为致病性突变。

国内外PPGL诊疗指南均建议对所有的PPGL患者常规进行基因检测。检索HGMD发现目前与PPGL发生相关的SDHB基因突变至少有190种，包括剪接突变、错义突变和移码突变等。本研究通过对1例PPGL患者行基因检测，发现了SDHB基因的1个新发剪接杂合胚系突变：c.423＋1G>T；进一步提取肿瘤组织mRNA进行反转录，然后扩增目的cDNA片段并测序，发现突变位点上游即第4外显子末端缺失54个编码序列，预测编码后的SDHB缺失第124～141位的18个氨基酸，预测该突变为致病性突变，且未见报道。该位点已报道的2种突变分别为"c.423＋1G>A"和"c.423＋1G>C"，Jean等发现"c.423＋1G>A"突变后转录的mRNA在第4外显子末端丢失54个碱基，与"c.423＋1G>T"具有相同的剪切机制^[5,6]。

SDHB是线粒体复合酶Ⅱ的重要组成和功能区域，合并SDHB基因突变的PPGL患者肿瘤组织线粒体复合酶Ⅱ活性丧失^[4]。SDHB肽链的第41～148位氨基酸形成SDHB的功能结构域，具有4个保守的半胱氨酸残基，在α卷曲和β折叠的基础上形成以Fe-S为核心结构的酶促中心(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)。Astuti等^[3]对SDHB氨基酸保守性分析结果显示，第129～131、138～140位氨基酸高度保守。该突变导致SDHB第124～141的18个氨基酸丢失，导致突变后的SDHB的氨基酸链明显缩短，丢失6个保守的氨基酸，可能导致其功能域形成障碍，从而导致SDHB亚基功能域受损。曾正陪等^[7]研究发现，SDHB基因突变导致PPGL肿瘤组织SDHB、SDHC表达缺失，提示SDHB和SDHC在线粒体内膜上表达障碍，所以该突变也有可能导致SDHB在线粒体膜上表达缺失。但是由于条件所限未能进一步行肿瘤组织的SDHB免疫组织化学染色和线粒体功能研究。

恶性PPGL患者预后较差，5年生存率<50%^[8]，对于良恶性PPGL的鉴别主要依据非嗜铬组织器官的转移灶，部分PPGL患者在切除原发灶后数年才出现转移灶，所以早期识别恶性PPGL是目前临床工作的重点和难点。大量的研究提示SDHB基因突变与PPGL患者的发病年龄早、异位、复发及恶性高度相关，且同一家系中SDHB基因突变携带者的外显率随着年龄逐渐增加，SDHB基因突变目前已经成为恶性PPGL的重要预测指标^[5,9,10]。该患者青少年期发病、肿瘤直径>5 cm、位于肾上腺外、压迫下腔静脉，合并SDHB基因突变，根据王卫庆等^[11]制定的基于分子标志物的嗜铬细胞瘤转移预测系统评估该患者具有高度转移风险。术前该患者病变部位¹³¹I-MIBG显像阳性，同时明确无多发和转移情况；为明确手术效果，术后1个月再次行¹³¹I-MIBG显像明确原发部位无肿瘤组织残留，复查24 h尿肾上腺素、去甲肾上腺素均正常，排除残余肿瘤组织原位复发可能。Van Slycke等^[12]的研究显示，约1/4的腹部副神经节瘤患者术后会出现原位复发。目前该患者具有高度转移风险，且携带SDHB基因突变的患者有可能伴发其他系统的恶性肿瘤如胃肠道间质瘤等^[11]，我们将对患者进一步密切随访。

综上所述，本文通过1例PPGL患者发现了SDHB基因新发剪接杂合胚系突变c.423＋1G>T，该突变导致转录后mRNA第4外显子下游被异常剪切掉54个编码碱基，突变后编码的SDHB缺失18个氨基酸，为致病性突变。但患者为养女，我们无法通过患者生物学父母的DNA进行进一步验证。该患者具有较高的转移风险，我们将对其进行密切随访。