探讨大鼠神经源性尿路功能障碍(neurogenic urinary tract dysfunction，NUTD)输尿管平滑肌细胞(ureteral smooth muscle cells，USMC)超微结构改变及小电导钙激活钾通道(small-conductance Ca2＋-activated K＋ channels，SKca)表达变化。
选取45只SD大鼠随机平均分为NUTD组、实验对照组(EC组)和空白对照组(BC组)。其中NUTD组给予破坏S1～4脊髓节段，术后1周行影像尿动力学检查，证实存在逼尿肌无收缩但无膀胱输尿管发生反流；EC组仅咬除棘突，未破坏脊髓；术后1周行影像尿动力学检查，证实无明显膀胱尿道功能障碍。模型建立后6周三组大鼠均行影像尿动力学检查，输尿管功能和形态学及USMC超微结构观察，并应用荧光定量PCR和Western-blot检测USMC SKca mRNA和蛋白表达情况。
模型建立后6周NUTD组大鼠膀胱均表现为无逼尿肌过度活动、膀胱逼尿肌无收缩。30 min内NUTD组产生尿量为(0.90±0.17)ml，EC组为(0.86±0.18)ml，BC组为(0.94±0.15)ml三组间差异无统计学意义；但NUTD组输尿管蠕动频率(16.23±2.35)次/5 min显著低于EC组(21.80±1.97)次/5 min和BC组(20.47±2.48)次/5 min，差异有统计学意义(P<0.05)。NUTD组USMC中SKca2和SKca3蛋白表达显著上调，mRNA表达相对于BC组平均分别上调4.15和4.56倍，差异有统计学意义(P<0.01)。电镜下可见NUTD组USMC排列散乱，线粒体体积增大水肿、数量增多，线粒体嵴增粗、髓样变，部分细胞可见线粒体内膜和嵴膜的大量破坏。
USMC超微结构改变和SKca表达水平上调可能是输尿管原发性功能障碍的重要机制之一。
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神经源性尿路功能障碍(neurogenic urinary tract dysfunction，NUTD)是指与排尿有关中枢或神经受到损伤出现的尿路功能障碍，保护上尿路为其基本治疗目的[1,2]。研究发现小电导钙激活钾通道(small-conductance Ca2＋-activated K＋ channels，SKca)在负反馈调节平滑肌细胞内钙离子动员信号，有效稳态调节平滑肌细胞兴奋性中起着重要作用；同时超微结构改变，特别是线粒体变化在平滑肌收缩发生中扮演重要角色[3,4]。然而NUTD输尿管平滑肌细胞SKca变化情况和超微结构变化尚不清楚。本研究通过对NUTD大鼠USMC进行SKca表达检测及超微结构观察，以便更全面的了解NUTD上尿路功能异常机制，为预防反流性上尿路损害发生和阻断其进展提供新思路。
选取45只SD雌性大鼠(200±20)g编号后查随机数字表随机均匀分为NUTD组、实验对照组(experimental control group，EC组)、空白对照组(blank control group，BC组)。实验大鼠由郑州大学实验动物中心提供，本研究经郑州大学实验动物伦理委员会批准。
Trizol购自Invitrogen公司；逆转录试剂盒及2×UItraSYBR Mixture(With ROX)购自北京康为世纪公司；PCR引物及内参由上海生工公司合成。7500 Real time PCR仪(AB公司)；抗大鼠SKca2多克隆抗体(Fantibody公司)；抗大鼠SKca3多克隆抗体(abcam公司)；β-actin兔多克隆抗体(BBI公司)；MMS尿动力仪、移动式C臂X线机(型号BV Endura)；瑞典LKB型超薄切片机；光镜(LEICA，型号DMI4000B)；电镜(日本电子，型号JEM-1400)；丙烯酰胺、四甲基二乙胺(TEMED)、过硫酸铵(AP)、硝酸纤维素膜、脱脂奶粉、ECL发光试剂盒、显影剂及定影剂。
①NUTD组：麻醉后破坏L1椎体，暴露并离断相应脊髓节段，捣毁骶段脊髓[5,6]。术后1周对大鼠进行影像尿动力学检查，均存在逼尿肌无收缩(acontractile detrusor，ACD)，无膀胱输尿管反流，为动物模型建立标准；②EC组：只咬除L1棘突，未破坏脊髓。术后1周行影像尿动力学评估证实无明显膀胱尿道功能障碍；③BC组：不进行任何手术处理，经影像尿动力学评估证实无明显膀胱尿道功能障碍。
模型建立后6周三组大鼠均经尿道留置6F双腔测压管，使用MMS尿动力仪和移动式C臂X线机进行影像尿动力学检查，主要包括压力容积和压力流率测定。记录充盈期膀胱形态，以及最大膀胱测压容量(maximal cystometric capacity，MCC)、膀胱顺应性(bladder compliance，BC)和逼尿肌漏尿点压(detrusor leak point pressure，DLPP)(若无漏尿发生则取排尿前最大逼尿肌压力为逼尿肌漏尿点压)。监测是否存在膀胱输尿管反流(vesicoureteral reflux，VUR)、逼尿肌过度活动(detrusor overactivity，DO)和逼尿肌无收缩(acontractile detrusor，ACD)。
完成影像尿动力学检查后，建立尾静脉留置通路，以2 ml/h恒定速度微泵泵入生理盐水。取下腹正中切口，游离暴露左侧输尿管，经尿道测压管抽尽膀胱内尿液。观察输尿管蠕动规律后，记录6组5 min左侧输尿管蠕动次数(ureteral peristals，UP)并求平均值(次/5 min)及30 min内膀胱内产生的尿量(urinary volume，UV)。有效输尿管蠕动定义为肾盂生理性充盈后，于肾盂输尿管连接部形成的一个尿液团块在输尿管壁规律连续向下蠕动收缩作用下传输至输尿管末端的过程。最后切取左侧下段输尿管0.5 cm立即放入4%多聚甲醛中固定，经脱水、石蜡包埋，切片行HE染色；将剩余部分－80 ℃超低温冰箱保存，用于USMC中SKca mRNA和蛋白表达的检测。切取右侧下段输尿管0.2 cm立即放入2.5%戊二醛固定液中固定，经冲洗、固定、脱水、包埋、聚合，切片行电镜下观察。再将剩余部分快速放入－80 ℃超低温冰箱保存，用于蛋白表达检测。
①荧光定量PCR测定：参照文献合成引物(表1)。使用Ttrizol按一步法来提取总RNA，逆转录反应后行PCR扩增反应；②蛋白质印迹法检测根据Western Blot常规操作进行蛋白提取、上样、转膜、封闭、抗体孵育、显色、曝光并分析。
SKca2、SKca3及GAPDH的PCR引物序列
SKca2、SKca3及GAPDH的PCR引物序列
| 指标 | 引物序列 | 扩增产物 |
|---|---|---|
| SKca2 | F TGGACAATGGAGCAGATGAC | 100 bp |
| R CCAGGGATGGGATGAATAGC | ||
| SKca3 | F GATGGACACTTCTGGGCACT | 101 bp |
| R GTTGCTGCTGTTGCTCGTC | ||
| GAPDH | F ACAGCAACAGGGTGGTGGAC | 258 bp |
| R TTTGAGGGTGCAGCGAACTT |
所得数据采用SPSS 17.0软件进行处理，检验各组变量正态分布情况，计量资料用
±s表示，整体比较采用ANOVA分析，组间比较用LSD检验。P<0.05为差异有统计学意义。
建模后6周行影像尿动力学检查发现NUTD组除2只大鼠死亡外，均表现为ACD，无逼尿肌过度活动及输尿管反流发生(图1)；其MCC和BC显著高于EC组和BC组，而DLPP显著低于另外两组，,差异有统计学意义(P<0.05)。在2 ml/h恒定速度静脉推注生理盐水条件下，30 min内产生尿量在3组之间差异无统计学意义，但左侧输尿管蠕动次数NUTD组显著低于EC组和BC组，差异有统计学意义(P<0.05，表2)。
大鼠输尿管蠕动次数及尿动力学参数(
±s)
大鼠输尿管蠕动次数及尿动力学参数(±s)
| 组别 | n | UP | UV(ml) | MCC(ml) | DLPP(cmH2O) | BC(ml/cmH2O) |
|---|---|---|---|---|---|---|
| NUTD组 | 13 | 11.23±2.35ab | 0.90±0.17ab | 4.00±1.67ab | 19.38±4.80ab | 0.28±0.10ab |
| EC组 | 15 | 16.80±1.97 | 0.86±0.18 | 0.96±0.22 | 34.27±3.90 | 0.03±0.01 |
| BC组 | 15 | 15.47±2.48 | 0.94±0.15 | 1.02±0.25 | 33.60±4.64 | 0.03±0.01 |
注：NUTD组与EC组之间比较，aP<0.05；NUTD组与BC组之间比较，bP<0.05
1A.BC组；1B.EC组；1C.NUTD组
荧光定量PCR示NUTD组USMC中SKca2和SKca3 mRNA表达相对于BC组平均分别上调4.15和4.56倍，差异有统计学意义(P<0.001，表3)。Western-blot灰度值分析，BC组、EC组、NUTD组SKca2蛋白表达量分别为0.81、0.76、1.14；BC组、EC组、NUTD组SKca3蛋白表达量分别为0.72、0.73、1.04。NUTD组的SKca2和SKca3蛋白表达相对于BC组、EC组显著上调，差异有统计学意义(P<0.01，图2、图3)；而SKca2和SKca3蛋白表达在EC组和BC组间差异无统计学意义。
荧光定量法检测SKca2、SKca3在三组大鼠输尿管中的相对表达水平(
±s)
荧光定量法检测SKca2、SKca3在三组大鼠输尿管中的相对表达水平(±s)
| 组别 | n | SKca2 | SKca3 |
|---|---|---|---|
| NUTD组 | 13 | 4.15±0.85ab | 4.56±0.72ab |
| EC组 | 15 | 1.28±0.12 | 0.96±0.09 |
| BC组 | 15 | 1.01±0.17 | 1.41±0.16 |
注：NUTD组与EC组比较，aP<0.01；NUTD组与BC组比较，bP<0.01
注：A.BC组；B.EC组；C.NUTD组
注：A.BC组；B.EC组；C.NUTD组
建模后6周光镜下3组输尿管内膜、肌层、外膜未见明显充血、水肿及炎细胞浸润(图4)。
我们在前期的研究中证实，NUTD发生扩张性上尿路损害机制除下尿路功能障碍的继发性尿动力学高危因素外，输尿管原发性功能障碍也是重要因素；输尿管这种原发性功能障碍在未发生光镜下病理改变时即已存在，大电导电压依赖钙激活钾通道(big-conductance Ca2＋-activated K＋ channels，BKca)的异常表达抑制USMC的兴奋性和收缩性可能是输尿管功能障碍的原因之一[7]。本研究在上,述结果基础上，继续对USMC Ca2＋动员信号通路负反馈调节SKca通路以及USMC超微结构的变化进行研究，以更全面深入了解神经源性尿路功能障碍发生扩张性上尿路损害的机制，为临床监测、预防及治疗上尿路损害提供新思路新方法。
本研究在建立逼尿肌无收缩和无膀胱输尿管反流的大鼠神经源性尿路功能障碍模型6周后再次影像尿动力学评估时，发现NUTD组仍无明显引起上尿路扩张的下尿路继发性尿动力高危因素，如相对于EC组和BC组，NUTD组逼尿肌漏尿点压出现降低、最大膀胱压测定容量和顺应性显著增加。然而，尽管此时没有发现存在膀胱输尿管反流，但已经存在显著输尿管原发性蠕动功能障碍，表现为蠕动次数显著下降。Roshani等[8]研究发现输尿管平滑肌细胞正常持续收缩形成的尿液团块单向传输是输尿管主动抗反流机制。本研究结果提示神经源性尿路功能障碍病变早期即出现的输尿管蠕动功能障碍必然导致输尿管主动抗反流机制受损，这要求对于该类患者在防止上尿路扩张损害时，不仅要关注下尿路继发性尿动力学高危因素，还要关注输尿管自身原发性功能障碍的发生情况及其机制。
钙激活钾通道在调节平滑肌的功能中具有稳态的平衡作用。而Lang等[9]发现Ca2＋内流是包括Cajal间质细胞(ICC)在内的非典型平滑肌细胞兴奋的源点，这类细胞可能是泌尿系潜在的起搏器，能在支配肾盂输尿管蠕动功能的神经系统受损的情况下接管起搏活动[10,11]。Kuvel等[12]和Koleda等[13]进而在临床研究共同证实了肾盂输尿管连接部梗阻患者输尿管神经纤维与Cajal间质细胞失代偿性减少，最终出现输尿管蠕动功能降低。因此，作者推测Ca2＋相关通道的表达发生改变可能是由神经系统的损伤导致输尿管ICC的减少而引起，进而影响输尿管的蠕动收缩功能。平滑肌中Kca是与钙相关的主要离子通道之一。SKca3已被证明是治疗膀胱过度活动(overactive bladder，OAB)的潜在作用靶点，其在OAB逼尿肌细胞内表达量明显减少[14]。本研究发现NUTD组大鼠USMC SKca表达量显著增高。研究表明SKca由动作电位期间的钙内流激活，其驱动平滑肌细胞趋于超极化状态而降低其兴奋性的作用在膀胱逼尿肌中得到证实[15]，可通过后超极化电位，抑制电压依赖性钙通道VDCs开放，从而调节动作电位和不应期时程，降低膜电位反馈抑制组织的兴奋性和收缩性[3,4,16]。这提示NUTD大鼠存在亢进的SKca途径，从而增强了负反馈输尿管平滑肌细胞兴奋性和收缩性的能力[17]。平滑肌在SKca阻断后张力增加、膜去极化，动作电位幅度增大[18]进一步调控肌细胞的收缩状态；然而，NUTD大鼠这种调节机制存在显著异常，是致使其兴奋性和收缩性异常重要因素，从而导致输尿管原发性功能障碍。
以上钙离子通道表达量的变化必然引起细胞内[Ca2＋]i改变，有研究者指出线粒体内[Ca2＋]i异常增高，发生钙超载，进而导致线粒体肿胀功能失调最终导致输尿管平滑肌能量代谢障碍、收缩功能受损[19]。线粒体可随细胞收缩频率变化从胞质摄取相当数量的Ca2＋，并随[Ca2＋]i的变化而变化，这一现象已在内皮细胞、肝细胞、卵巢细胞及平滑肌细胞得到证实[20]。同时Dolga等[21]指出SKca能够防止线粒体内过氧化产物堆积及钙超载，并能够避免线粒体因基质渗透而肿胀，SKca通道的衰减能够减弱线粒体钾电流，导致线粒体跨膜电位的损失，进而阻止线粒体分裂及线粒体凋亡蛋白的释放，SKca的表达异常可能是导致线粒体功能降低的重要机制。有文献表明线粒体及[Ca2＋]i的变化在肺动脉及子宫平滑肌收缩的发生中扮演重要的角色[22,23]。对神经源性膀胱逼尿肌细胞病理尤其是超微结构的变化已有大量文献报道，而对输尿管平滑肌细胞病理学改变及超微结构研究尚未见[24,25]。据此，我们通过透射电镜对三组大鼠USMC超微结构进行观察，结果显示NUTD组USMC线粒体数量增加、体积轻度增大可能是疾病早期代偿性保障输尿管正常的收缩功能的表现；线粒体明显肿胀，线粒体内膜的破坏，嵴断裂甚至消失，甚至出现了线粒体空泡化导致线粒体功能严重受损。线粒体内膜和嵴膜的大量破坏可导致氧化磷酸化功能障碍及ATP的合成减少，无法保证正常的输尿管蠕动功能。本实验结果显示单位时间内NUTD大鼠输尿管蠕动次数显著减少验证了这一病理变化所导致的结果。线粒体本身具有十分完善的Ca2＋摄取和释放系统，可以敏感而快速地感受细胞内Ca2＋所代表的信息变化[26]，其损害是可逆细胞损害的最可靠的早期表现之一。实验结果显示NUTD组USMC在光镜下无明显病理变化，但输尿管功能及USMC超微结构已经发生了改变，这与NUTD患者膀胱逼尿肌细胞电镜下改变是相似的[25]。由此推测USMC超微结构的改变可能是造成其原发性功能障碍的直接因素。
综上所述，本研究发现USMC SKca表达水平上调和显著超微结构改变，特别是线粒体的变化，可能是输尿管原发性功能障碍重要原因。目前对神经源性尿路障碍药物治疗主要局限在作用于膀胱逼尿肌的拟胆碱能、抗胆碱能药物，作用于尿道括约肌的α或β-肾上腺素能兴奋剂、阻滞剂以及减少膀胱传入冲动的神经毒性药物等；其在改善下尿路症状，提高患者生活质量方面起到一定的作用；但对上尿路损害预防疗效方面仍不理想[27]。根据SKca的Ca2＋依赖性及本研究结果大胆推测SKca受体特异性阻断剂的应用，将有效降低Ca2＋负荷对USMC线粒体的损害、维持正常输尿管平滑肌功能，并在一定程度上减少了负作用。对神经源性尿路功能障碍及USMC Ca2＋动员信号通路的研究有助于明确输尿管的功能调节及原发性功能障碍的发生机制，为维持NUTD患者输尿管的蠕动功能，预防反流性上尿路损害的发生提供新思路。同时深入研究USMC的Ca2＋动员相关粒子通道和受体调节剂对其钙瞬变和收缩的作用，筛选出特异的激动剂及阻断剂具有非常广阔的医用前景。
