探索从人类先天性巨结肠患儿的扩张段肠管提取肠神经干细胞的可行性，为进一步开展先天性巨结肠的神经干细胞自体移植治疗研究提供依据。
利用1例先天性巨结肠手术切除的扩张段肠管，进行酶消化后，制成单细胞悬液，经体外培养形成神经球，并通过CCK8法检测肠神经干细胞在24 h、48 h、72 h、96 h、120 h和144 h六个时间点的OD值，绘制生长曲线，记录增殖情况，通过Nestin、GFAP和TUJ-1细胞免疫荧光化学染色对肠神经干细胞及其分化而来的神经元和神经胶质细胞进行鉴定。
来自扩张段肠管的单细胞悬液通过原代体外培养10 d，可见神经球形成；肠神经球随时间逐渐变大，CCK8法观察肠神经干细胞的OD值随时间而逐渐增高；形成的神经球可以继续传代，经细胞免疫荧光化学染色为Nestin染色阳性，并可分化为神经胶质细胞(GFAP染色阳性)和神经元细胞(TUJ-1染色阳性)。
能从人类先天性巨结肠患儿的扩张段肠管提取具有自我更新能力的肠神经干细胞，可用于先天性巨结肠的神经干细胞自体移植治疗研究。
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先天性巨结肠(Hirschsprung's disease，HD)是小儿常见的先天性胃肠道畸形之一，大多数需要手术治疗[1,2]，但外科手术为创伤性的对症治疗方法，不能从根本上恢复肠道功能，许多患儿术后肠道运动紊乱仍然持续存在，甚至需要再次手术[3]。通过移植肠神经干细胞(enteric neural stem cells，ENSCs)至神经元发育缺陷肠段，恢复正常肠神经系统和神经元的结构和功能，达到根治HD的目的，是一种理想的治疗方法，具有临床应用前景[4]，但目前该治疗方法尚处于动物实验阶段。现在能从动物及人类胚胎的肠道提取肠神经干细胞(neural stem cells，NSCs)[5]，但从生后人类的肠道提取ENSCs，较为困难，阻碍了研究的进展；而从成体人类HD患者的肠管提取ENSCs，国际上仅少数几家研究单位获得成功[6,7,8,9,10,11]。本实验试图从HD手术患儿的扩张段肠管标本中提取ENSCs，确定其生物学特性，为今后进一步进行人类ENSCs的移植应用奠定基础。
标本来源于温州医科大学附属第二医院育英儿童医院，为1例11个月龄男性HD病例手术切除的扩张段肠管，术中快速冰冻切片证实所取肠管切缘含有神经节细胞。标本的获得征得患儿家长的知情同意，并符合赫尔辛基宣言，且得到医院伦理委员会的批准(编号：2012-24)。
DMEM/F12基础培养基、MEM培养基、表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、人纤维连接蛋白(human fibronectin，HFN)、D-hanks液、N2添加剂、B27添加剂、青链霉素、L-谷氨酰胺、胎牛血清、多聚鸟氨酸均为美国Gibco公司产品，Accutase酶、四型胶原酶、分散酶、核染料PI均为美国sigma公司产品，CCK-8试剂盒为日本同仁公司产品，一抗兔抗人Nestin、兔抗人GFAP及小鼠抗人TUJ-1来源自美国abcam，工作浓度分别为1∶200、1∶1000及1∶1000，二抗为FITC标记的羊抗兔IgG和大鼠抗小鼠IgG，均为中国武汉博士德公司产品。
100 ml完全培养基中含：95 ml DMEM/F12基础培养基、1 ml N2添加剂、2 ml B27添加剂、2 μg EGF、2 μg bFGF、1 ml青链霉素、1 ml L-谷氨酰胺；100 ml分化培养基在完全培养基的基础上再添加10 ml胎牛血清。
手术切除肠管后立即取下标本(图1)，生理盐水反复冲洗以除去肠内容物，置于含2%青链霉素的MEM液的离心管中。用解剖显微手术器械除去肠管周围结缔组织及黏膜层，剥取肌层置于含1%青链霉素的D-hanks液中备用。整个过程都在冰上操作，不超过30 min。然后用显微剪将其剪碎(0.5～1 mm3大小)，加入胶原酶XI(1.0 mg/ml)和分散酶Ⅱ(250 μg/ml)，37℃孵育4 h，消化后用200目筛网过滤，两次离心后取沉淀加入完全培养液重悬，吹打均匀，台盼兰染色细胞计数并调整细胞密度为106/ml，接种到事先用HFN(2 μg/cm2)和多聚鸟氨酸混合包被的培养瓶中贴壁培养。每隔2 d半量换液一次，观察细胞形态、直径及密度。
当肠神经球出现并不再变大时，用吸管除去培养液，将事先于37℃下预热过的ACCUTASE酶2 ml加入到培养瓶中，消化3～5 min，吹打均匀，将细胞悬液吸至15 ml离心管中离心(1 000 r/min，5 min)，用完全培养基重悬后计数，调整至适当浓度后分装入25 cm2培养瓶即可传代培养。进行促分化试验时只需将完全培养基换成促分化培养基。将传至第三代的ENSCs消化成单个细胞进行CCK-8试验，用酶标仪测定各孔在450 nm处的吸光度(OD值)，检测ENSCs生长情况。
将传至第三代的ENSCs消化后的单细胞悬液滴加到HFN处理过的盖玻片上，分别加入普通培养基和促分化培养基于12孔板中37℃、5%CO2条件下继续培养4～5 d，神经球贴壁形成和神经球分化后，加4%多聚甲醛固定室温下固定，进行Nestin、GFAP及TUJ-1免疫荧光化学染色法染色鉴定神经球及分化细胞类型，并于荧光显微镜下观察并取图。
原代培养至第二天开始出现有单个的贴壁ENSCs(图2A)，至第五天贴壁的ENSCs增多，在第10天开始形成明显的神经球(图2B)，形状以椭圆形为主，折光性较强。之后神经球逐渐变大，形状趋于圆形，培养至15 d时神经球不再变大，中心略发黑且折光性下降，并以神经球为中心相互连接成蜘蛛网状结构(图2C、图2D)。这是由于神经球过大，中心细胞得不到足够营养支持所致。传代至第2代后神经球成球速度与原代相差不大，传至第3代后，神经球成球速度迅速加快，传代后5～6 d即可出现神经球。传至第六代后ENSCs增殖能力明显减弱。
CCK-8法测ENSCs生长曲线见图3。传代培养至第三代后，ENSCs相对比较稳定，细胞的纯度也较高，利用CCK-8法测得ENSCs在24 h、48 h、72 h、96 h、120 h和144 h六个时间点的OD值(表1)，作出ENSCs的生长曲线。由图可知，OD值随着时间变化而逐渐增高，至120 h开始下降。
CCK-8法测得传代至第3代的ENSCs6个不同时间点的OD值
CCK-8法测得传代至第3代的ENSCs6个不同时间点的OD值
| 时间点 | 有效孔1 | 有效孔2 | 有效孔3 | 平均数 |
|---|---|---|---|---|
| 24 h | 0.154 | 0.193 | 0.149 | 0. 165 |
| 48 h | 0.212 | 0.236 | 0.216 | 0.221 |
| 72 h | 0.370 | 0.337 | 0.344 | 0.350 |
| 96 h | 0.586 | 0.541 | 0.570 | 0.566 |
| 120 h | 1.154 | 1.241 | 1.184 | 1.193 |
| 144 h | 0.970 | 0.995 | 1.004 | 0.990 |
注：每个时间段的5组复孔中，除去最大值和最小值，减去相应空白对照组的数值即为有效孔的OD值
在普通培养基培养下的ENSCs形成神经球之后即可用细胞免疫荧光化学染色技术作Nestin鉴定。神经球内大部分ENSCs均显示Nestin标记蛋白阳性，在荧光显微镜下可见神经球显示绿色荧光，胞核PI染色呈红色(图4)。
原代及传代培养形成的肠神经球经含10%胎牛血清的分化培养基诱导分化后，经免疫细胞荧光染色，在荧光显微镜下可见神经元及神胶质细胞显示绿色荧光，胞核PI染色呈红色。神经胶质细胞的胞体及突起呈GFAP强阳性着色，胞体较小(图5)，而神经元呈TUJ-1强阳性着色，突起长、分支广泛，呈神经元典型形状(图6)。提示所培养的细胞为ENSCs，并可以分化为神经胶质细胞和神经元。
目前神经干细胞移植治疗HD尚处于动物实验研究阶段。用于移植治疗的NSCs主要可能来源有胚胎干细胞、诱导多功能干细胞、中枢神经系统的NSCs、直接提取自肠道的ENSCs和来源于间充质干细胞的诱导分化[4]。各种不同来源的神经干细胞有各种不尽相同的生物学和免疫学特性，当它们移植入消化道用于治疗HD时，必然会有不同的效果。移植的NSCs必须适应局部环境，才能存活，并增殖、分化为所需要的神经元；移植的NSCs产生的神经元必须合成缺陷的肠神经元所对应的神经递质，并且形成精确的突触连接，才会产生治疗效应[12]。从神经生物学理论来看，ENSCs可能是HD移植治疗中最为合适的移植干细胞源，这不但消除了移植的伦理障碍和免疫排异问题，同时自身肠道的ENSCs可能更易与病变肠管神经元缺陷的神经网络建立连接，产生最佳的治疗效果[4]。在将来的临床应用中，用于HD自体移植治疗的正常肠管组织可来源自新生儿期的肠管造瘘口、后期的肠管壁组织活检等，也可通过内镜微创组织活检来获取肠管壁组织。
在人类，Rauch等[6]首先从人孕9周胎儿到5岁儿童非HD患儿的活检或流产胎儿肠壁，提取和培养出肠神经球，植入离体培养的人肠管壁中能够生长。Almond等[7]和Lindley等[13]从人类新生儿(其中1例为HD病例)肠道提取肠神经球，移植入体外培养的胎鼠无神经节细胞肠管组织块中，ENSCs能从神经球中移行出来，分化成为神经胶质细胞和神经元，并能恢复肠道平滑肌收缩性。Metzger等[8,14]通过内镜微创组织收集，利用活检的肠黏膜提取多潜能NSCs，移植到体外培养的鸡和人无神经节细胞肠段，能产生神经元和神经胶质细胞。最近Hagl等[10]从人体手术切除的阑尾中成功提取到ENSCs，并在体外培养成功，但国内尚无从人类成体肠管组织中提取并培养成功的报道，仅见潘伟康等[15]从流产胎儿提取成功的报道。
与大鼠、小鼠等动物ENSCs提取相比，人类ENSCs的提取更加困难。就标本来源而言，人体标本非常稀少，显得格外珍贵。对动物ENSCs的研究可以为人类ENSCs的研究提供很多参考基础，但两者之间毕竟存在着种属差异，动物疾病模型并不能完全模拟人类疾病的真正进展。从成体肠管中提取ENSCs比从胚胎中提取难度更大，因为胚胎中的ENSCs处于发育阶段，其增殖能力比成体肠管的强，数量也更多，但干细胞治疗的最终目的是从自体肠管中提取正常的ENSCs移植到病变肠管，所以从成体肠管中提取ENSCs更具临床价值。
从成体提取ENSCs首先需解决的问题是标本来源与污染问题。本实验所取标本来自于HD患儿切除肠管的扩张段，该扩张段实为被动扩张段，术中快速冰冻切片证实切缘含有正常的神经节细胞，故应含有正常的ENSCs。标本只取系膜缘对侧的肠管，便于清洗和后续操作，且避开系膜血管，消化后可减少杂质。由于患儿肠管中有各种细菌，污染是培养中必须解决的问题，解决的办法就是快速剥离肠黏膜和反复洗涤：在手术取下标本之后，立即将标本放至预冷的生理盐水中反复冲洗，在冰浴环境下尽快将标本转移至实验室，尽快将肠管黏膜和肌层剥离，然后用含2%青链霉素的HBSS再次反复冲洗。其次要解决的问题是用于消化组织的酶的选取以及消化时间的掌握。Rauch等[6]和Hagl等[10]采用的是单独的胶原酶，而Almond等[7]、Metzger等[8,9]和Edger等[16]则采用胶原酶和分散酶的混合酶，Grundmann等[17]的则联用Liberase TH酶和DNA酶。经过无数次预实验对比，我们最终选择了联用胶原酶和分散酶，消化时间在4h以上。另外，培养瓶或者六孔板必须用纤维蛋白原包被过夜，否则细胞难以贴壁。然后要注意的是培养基的配制。NSCs的培养必须是无血清的培养基，在DMEM/F12基础上我们添加了bFGF、EGF、B27添加物、N2添加物、青链霉素、L-谷氨酰胺，有些实验室在配制时还添加了胶质细胞源性神经营养因子(glial cell-derived neurotrophic factor ，GDNF)[6,10]和睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor, CNTF)[6]，也有的添加了条件培养基[8,9]或鸡胚提取物[7]，我们发现这些添加物并不是必须的，添加之后能使神经球能长得更好，成球速度更快，但不添加并不会导致培养失败，我们的意见是原代培养可适当添加，传代以后可以不添加。
我们不用机械吹打的方法来传代，而是使用ACCUTASE酶消化后用巴氏吸管轻轻吹打，就可以得到单细胞悬液，这样可以避免机械吹打对细胞造成的损害，提高传代后细胞的成活率。我们也曾尝试用胰酶消化，但是胰酶对细胞活性影响大，消化时间必须严格控制，消化效果不佳。
在无血清培养基培养下，其他细胞逐渐死亡，只留下ENSCs继续生长，形成神经球，用血清诱导分化后，ENSCs可以分化为神经元、神经胶质细胞。目前，鉴定神经干细胞最常用的标志物为Nestin蛋白[18]。而GFAP和TUJ-1则分别是神经胶质细胞和神经元的特异性标志物。本实验培养的细胞能在无血清培养基下增殖，并形成神经球，Nestin免疫荧光染色呈阳性，表明神经球尚处于未分化的干细胞阶段，诱导分化后的GFAP和TUJ-1免疫荧光染色结果呈阳性，说明ENCSCs经过分化后形成神经元和神经胶质细胞，具备了干细胞的多分化特点。
