建立小鼠肠神经前体细胞体外培养和纯化的方法，寻找合适的肠神经前体细胞转染方式进行增殖分化等功能实验，为研究肠神经系统发育及疾病奠定基础。
取胎龄16.5 d(E16.5)的ICR小鼠胚胎肠道，经胶原酶消化后制成单细胞悬液，接种到神经前体细胞培养基中，多次换液后进行免疫学鉴定。纯度达到95%的神经前体细胞使用lipo2000，RNAimax，慢病毒等三种方式进行mmu-miR-346转染，通过实时荧光定量PCR检测神经前体细胞内mmu-miR-346的表达来比较这三种方式的转染效率。使用EdU法检测肠神经前体细胞的增殖情况，通过分化培养基诱导检测肠神经前体细胞的分化情况。
培养第2天出现神经球，经过4次全换液，免疫学鉴定显示(96.85±0.5357)%细胞为Nestin/p75双阳性。lipo2000，RNAimax，慢病毒这三种转染方式中仅慢病毒方法的转染效率最高，能显著提升mmu-miR-346表达水平(差异倍数：117.45)。EdU阳性率与TuJ1阳性率分别从阴性对照组的(17.87±1.13)%和(24.87±0.6)%降至转染组的(6.73±0.43)%与(11.90±0.85)%，两组在增殖与分化中的差异均具有统计学意义(P<0.0001；P<0.001)。
通过分离消化E16.5小鼠肠道可以建立小鼠肠神经前体细胞培养和纯化的方法，慢病毒方法在肠神经前体细胞的转染效率最高，能成功进行增殖与分化实验，可以为肠神经系统发育和疾病的研究奠定基础。
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先天性巨结肠又称肠无神经节细胞症，是一类先天性肠神经系统发育异常性疾病，目前已证实多种因素通过影响肠神经嵴细胞的迁移、增殖和分化引起肠神经系统发育异常，参与先天性巨结肠的发生[1]。要研究肠神经系统的发育过程，就必须要用到研究肠神经元的工具细胞，但目前缺乏更合适的工具细胞来研究肠神经系统的形成过程，阻碍了先天性巨结肠等肠神经系统疾病的发病机制研究。目前国内外仅见到成功提取大鼠肠神经前体细胞作为工具细胞的报道[2,3]，但大鼠基因组与人类基因组匹配少，基因改造技术亦不成熟；而小鼠作为最好的模式动物之一，其基因组计划已基本完成，基因组序列的大量信息为研究基因功能及其表达调控、胚胎发育和疾病的分子机制提供了条件和技术手段。本研究成功提取了来源于小鼠的肠神经前体细胞(enteric neural progenitor cells，ENPCs)，确定了其生物学特性，寻找到最佳的转染方式，为先天性巨结肠等肠神经系统发育异常疾病的相关研究提供了更合适有效的工具细胞。
孕16.5 d ICR小鼠(SPF级)购于上海斯莱克实验动物有限公司。
DMEM-F12、N2-supplement、B27-supplement为Gibco公司产品；人碱性成纤维细胞生长因子bFGF、表皮生长因子EGF、胶原酶为Sigma公司产品；鼠抗TuJ-1为abcam公司产品，兔抗Nestin为Proteintech产品，DAPI(4'，6-diamidino-2-phenylindole，4'，6-二脒基-2-苯基吲哚)、二抗为相对应的FITC、Cy3试剂盒以及抗荧光淬灭剂均为碧云天公司产品；Lipo2000、RNAimax、Accutase购于thermo公司；EdU(5-ethynyl-2’-deoxyuridine，5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷)试剂盒(Cell-Light ™ EdU Apollo©567 In Vitro Imaging Kit)购于锐博生物科技有限公司；倒置显微镜、荧光显微镜为Olympus公司产品；CO2培养箱、悬浮细胞培养瓶为Thermo公司产品。
100 ml完全培养基中含95 ml DMEM/F12培养基、1 ml N2添加剂、2 ml B27添加剂、2 μg EGF、2 μg bFGF；100 ml分化培养基含90 ml DMEM/F12培养基、1 ml N2-supplement、B27-supplement、10 ml胎牛血清。
孕16.5 d的ICR小鼠颈椎脱臼处死，常规消毒后剖腹取胎鼠，分离出胎鼠肠管置入PBS中备用。解剖显微镜下用显微手术器械除去肠管系膜并将肠管剪碎(0.5～1.0 mm3大小)，1 mg/ml胶原酶37 ℃孵育60 min，不时混匀，200目筛网过滤，离心(1 000 r/min，离心半径6.4 cm)3 min取沉淀，DMEM-F12重悬，再离心(1 000 r/min，离心半径6.4 cm) 3 min，沉淀加入完全培养基重悬，吹打均匀，细胞计数并调整细胞密度为106/ml后接种到悬浮细胞培养瓶，37 ℃、5% CO2条件下培养，每隔2 d全换液一次，观察神经球生长情况。
将培养至第9天的肠神经前体细胞利用Accutase消化成单细胞，用普通培养基重悬，以5×105个细胞/ml滴加到多聚赖氨酸处理的96孔板上，37 ℃、5%CO2条件下继续培养1 d，当神经前体细胞贴壁后，去培养基，4%多聚甲醛室温下固定20 min，行Nestin、p75、DAPI免疫荧光化学染色法鉴定神经前体细胞。
引物：mmu-miR-346-F：ACACTCCAGCTGGGTGTCTGCCCGAGTGCCT；mmu-miR-346-R：CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAG-AGGCAG。U6-F：CTCGCTTCGGCAGCACA ；U6-R：AACGCTTCACGAATTTGCGT。URP: TGGTGTCGTGGAGTCG。FAM标记的mmu-miR-346 mimics订购于上海吉玛有限公司。慢病毒(Lentivirus，LV)构建测序结果：GTTTTAAAA-TGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAA-AGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCT-TGTGGAAAGGACGAAACACCGGGAGTCTCT-GCTCAACAGAGTTGGCCTCCTGGAGAGGCT-TCCTCATCTGTGATGCCACGGAAGACAGGG-CCGAGGTGCTGCGACCAGGCGGTTAGGAGG-T C T C T GTGTTGGGCGTCTGTCTGCCCGAGT-GCCTGCCTCTCTGTTGCTCTGAAGGAGGCA-GGGGCTGGGCCTGCAGCTGCCTGGGCAGAG-CTGCTCCTTCGAGGGACACACTGCTGGCTC-CTCTCTCTGGTTACAGACTCACGACGTCAT-GCCTCTGGTCTACAGCACACCTGACCTTCA-CAGCCAGCATGGGCATCACTTTTTTAATTC-TCGACCTCGAGACAAATGGCAGTATTCATC-CACGGATCCTAACCCGTGTCGGCTCCAGAT-CTGGCCTCCGCGCCGGGTTTTGGCGCCTCCC-GCGGGCGCCCCCCTCCTCACGGCGAGCGCTG-CCACGTCAGACGAAGGGCGCAGCGAGCGTC-CTGATCCTTCCGCCCGGACGCTCAGGACAG-CGGCCCGCTGC。
瞬时转染：转染前将神经球接种于六孔板中。取NC/miRNA-346 mimics 10 μl、lipo2000/RNAimax 5 μl，分别经普通培养基稀释至250 μl，于室温中作用5 min后将两者缓缓混合，静置20 min，滴加到六孔板中。Lipo2000转染6 h、RNAimax转染24 h后，换普通培养基继续培养48～72 h。稳定转染：转染前将神经球接种于六孔板中。取LV-NC/LV-miRNA346按照感染复数(multiplicity of infection，MOI)100∶1滴加到六孔板中，感染24 h后换普通培养基继续培养48～72 h。
取上一步分组的细胞，消化后置于96孔板后继续培养24 h后，加入终浓度为10 μmol/L的EdU，继续培养24 h。按照说明书进行EdU与细胞核(Hoechest3334)的染色后，荧光显微镜下拍照，每组按照上下左右中间的位置随机选取5个视野，分别计数EdU阳性细胞平均数及总细胞数(细胞核的总数)，最后用EdU细胞的阳性率表示神经前体细胞的增殖效率。
将培养至第9天的ENPCs利用Accutase消化成单细胞，用普通培养基重悬，以5×105个细胞/mL滴加到多聚赖氨酸处理的96孔板上，37 ℃、5%CO2条件下继续培养1 d，当神经前体细胞贴壁后，去培养基，用4%多聚甲醛室温固定20 min后，采用常规细胞免疫荧光染色，添加anti-TuJ1[4]，一抗4 ℃孵育过夜，之后加相应荧光二抗于室温孵育1 h，最后用1 μg/mL DAPI孵育5 min，加入抗荧光淬灭剂拍照。每组实验取16个不同的视野拍照，3次实验的结果用于统计分析。
所有数据统计均来自3次及以上的独立实验，数据处理分析采用GraphPad Prism 5软件，P<0.05为差异有统计学意义。qRT-PCR结果相对表达量采用2-ΔCT法表示，P<0.05表示差异有统计学意义。
原代细胞消化后接种到培养瓶中可见多数细胞为抱团生长(图1A)，培养1 d后即形成可见的悬浮神经球(图1B)，折光性较强，周围有较多散在的神经前体细胞以及其他杂细胞，随即进行全换液。神经球之后逐渐变大(图1C、图1E)，折光均匀，边缘明亮锐利，周围杂细胞逐渐变少。当培养至第9天时，神经球体积已达200～300 μm，中间开始发黑，折光性减弱(图1F)。
在培养至第9天时，用Accutase将神经球消化为单细胞，用细胞免疫荧光化学染色技术作Nestin/p75双鉴定。结果显示有95%以上的细胞显示Nestin/p75双标蛋白阳性，在荧光显微镜下可见肠神经前体细胞胞质显示红色荧光(Nestin)和绿色荧光(p75)，胞核显示蓝色荧光(DAPI)(图2)，证实为肠神经前体细胞。
用lipo2000及RNAimax转染的神经球(图3A、图3C)，荧光显微镜下几乎看不到转染成功所发出的FAM绿色荧光(图3B、图3D)；用慢病毒转染的神经球(图3E)，可见均匀散在的较强绿色荧光(图3F)。
实时荧光定量PCR检测目的基因mmu-miRNA-346转录后的表达结果显示：在lipo2000转染组内，空白对照组、阴性对照转染组、转染组mmu-miRNA-346相对表达量分别为0.005 144±0.000 973 4、0.007 613±0.002 119、0.008 202±0.001 100；在RNAimax转染组内，三组mmu-miRNA-346相对表达量分别为0.005 144±0.000 973 4、0.006 164±0.001 506、0.007 910±0.000 598 1；在慢病毒转染组内，三组mmu-miRNA-346相对表达量分别为0.005 144±0.000 973 4、0.005 428±0.000 257 5、0.636 6±0.069 25。三种阴性对照转染与空白对照组相比，mmu-miRNA-346表达差异无统计学意义(P>0.05)；三种转染组与相应阴性对照转染组相比，两种瞬时转染组mmu-miRNA-346表达差异均无统计学意义(P>0.05)，而慢病毒转染组mmu-miRNA-346表达较转染组显著升高，其差异具有统计学意义(P<0.000 1)，可作为最佳过表达转染方法用于后续实验研究。
肠神经嵴细胞(enteric neural crest cells，ENCCs)增殖和迁移、分化障碍导致的肠神经节细胞缺如是先天性巨结肠发生的病理基础[5]，其功能受到多种信号通路以及microRNA、lncRNA等多种调控因素的影响[6,7]，这就需要合适的工具细胞来研究ENCCs的增殖与分化等功能。目前通过大脑皮质分离获得的神经前体细胞以及胚胎干细胞分化的神经前体细胞已经广泛运用于神经系统疾病的研究之中[8,9]，而利用肠神经前体细胞进行肠神经系统发育和疾病机制研究在国内外还并不多见，仅数篇关于大鼠及人肠神经前体细胞提取培养的报道[2,3,10]，并且大鼠基因组与人类基因组匹配少，基因改造技术亦不成熟；而小鼠作为最好的模式动物之一，其基因组与人类基因组高度同源、基因组改造手段非常成熟[11]。但暂未有小鼠肠神经前体细胞培养、转染和功能研究的相关报道。
本研究首次成功提取了小鼠肠神经前体细胞。通过对E11.5到E18.5的小鼠胚胎的多次提取尝试，我们发现胎龄过小(E11.5～15.5)的胎鼠提取的神经前体细胞数量较少，难以形成神经球，增殖能力弱，晚期胎鼠(E17.5～18.5)的肠道内有金黄色粘稠物，虽然提取神经前体细胞后并无污染，但是有金黄色细胞球形成，目前难以鉴定其是否为神经前体细胞，而E16.5胎鼠可提取足量神经前体细胞且肠道内未见分泌物形成，所以本研究选取E16.5胎鼠进行肠神经前体细胞的提取培养。
目前常见的神经干细胞解离和传代方法包括机械吹打法[12]、胰蛋白酶[13]、TrypLE和Accutase消化法[14]等，本研究试用了机械吹打法，Accutase消化法，胰蛋白酶消化法对肠神经前体细胞进行传代，其中机械吹打法得到的是单个细胞和细胞球的混合物，单细胞与细胞球的增殖能力与生长状态并不完全一致，此外，分离时的吹打力度和吹打次数也不易掌握；胰蛋白酶是一般细胞最常用的分离消化液，但其消化时间不宜过长，否则易对细胞产生损伤；Accutase是胶原酶和蛋白水解酶的混合物，能温和地解离敏感细胞[14]。实验过程中，三种方式消化的细胞在接下来的培养过程中均难以形成神经球(观察时间超过14 d)，可能原因是机械吹打会有太多的组织块杂质，而利用酶进行消化易对细胞造成相应的损伤。但是相比于其他两种方法，Accutase消化外加巴斯德滴管吹打后细胞可呈均匀单细胞悬液，且细胞受损伤程度小，适宜直接铺板进行EdU及细胞分化实验。此外神经前体细胞不像胚胎干细胞，其内在的分化钟已经启动。所以难以用晚代次的细胞重复早代次的细胞做出的结果。因而本研究采取即取即用的策略，即所取神经前体细胞不进行传代操作，均在神经球长到200～300 μm时进行功能实验。这样就要求在神经球体积达到最大前要提纯细胞。胚胎肠道细胞刚刚提取时部分杂细胞会贴壁，可通过换液的方式去除，部分因为培养基中不含血清会在换液过程中逐渐死亡，目前绝大部分研究采取半换液的方式进行细胞提纯，但是提纯所需时间长，本研究在反复实验过程中采用全换液方式，即将细胞稍微静置后吸取上清以及其中的单个杂细胞，这样操作虽然会损失部分神经前体细胞，但是能在较短的时间内使神经前体细胞的纯度达到要求。鉴定肠神经前体细胞的标志物有巢蛋白( Nestin)、Vimentin，40 kD微管结合蛋白质( DCX)、硫酸软骨素蛋白聚糖2( NG2)、唾液酸神经细胞粘附因子( PSA-NCAM)、CD133、p75等[15]，其中Nestin在胚胎早期的神经上皮表达，当神经前体细胞朝向终末方向分化成神经元和胶质细胞时，Nestin便停止表达，故Nestin被认为是神经系统发育过程中神经前体细胞的标志之一[16]。而p75能从周围神经组织中鉴别出神经嵴细胞，并且在体外和体内可以自我更新和形成神经元[17]。因而本研究选取Nestin与p75作为肠神经前体细胞的标志物，后续鉴定发现，全换液4次左右再鉴定细胞基本可使神经前体细胞纯度达到95%，可用于接下来的功能实验。
细胞转染时本研究选取了2种瞬时转染试剂lipo2000以及RNAimax以及稳定转染慢病毒载体对神经球进行转染，选取了FAM荧光标记的miRNA-346(FAM-miRNA-346)检测瞬时转染效率，对照慢病毒载体用GFP绿色荧光蛋白标记检测稳定转染效率。Lipo2000和RNAimax均为阳离子脂质体类载体，利用该类载体转染具有操作简便、适合于各种裸露的DNA和RNA片段和各种细胞等优点，当然其对DNA浓度有一定要求，对细胞也有一定的毒性，其中Lipo2000对细胞损伤程度高于RNAimax，进行细胞转染时需将有血清培养基换成无血清培养基，RNAimax则可以直接进行转染而无须换液，两者均被验证可进行原代细胞转染[18,19]。慢病毒转染作为一种稳定转染方法则具有转染效率高、外源基因整合较稳定等优势，其适用于难转染细胞转染。在本实验中发现lipo2000与RNAimax两种转染试剂都不能有效转进肠神经前体细胞，更不能显著性高表达目的基因，原因可能在于肠神经前体细胞易形成群落，而群落间的细胞不容易暴露在化学或脂质转染试剂中，加之转染试剂一般有毒性，故转染时长不宜过长，导致转染效率低下。而用慢病毒转染细胞，神经球中均匀表达出绿色荧光，并且microRNA-346也在转染3 d后表达上升，这与中枢系统神经前体细胞可以进行慢病毒转染是一致的[20,21]。
之所以选择microRNA作为目的基因进行转染，是因为microRNA多位于基因组非编码区，进化上高度保守，可对基因表达进行调控，与生物的正常生理活动、个体发育、组织分化等密切相关，同时也与许多疾病的发生发展紧密相关[22]。microRNA表达发生改变，可导致组织细胞的发育、增殖、分化等异常，诱导疾病发生。目前microRNA的研究主要集中于肿瘤，如miRNA-221和miRNA-222能诱导胃肠道间质瘤细胞的凋亡[23]。但在先天性巨结肠以及其他相关肠神经系统发育障碍疾病中的研究才刚刚起步。有研究显示miRNA-346会促进鼻咽癌细胞的迁移与侵袭[24]，亦有报道称miRNA-346可促进非小细胞肺癌细胞的增殖与迁移[25]，此外本课题组前期研究发现miRNA-346能够影响SH-SY5Y细胞系以及293T细胞系的增殖与迁移能力，可能与先天性巨结肠的发生发展有关，且miRNA-346在人与小鼠中的同源性很好，故本研究中选择在肠神经前体细胞中过表达miRNA-346观察对其增殖以及分化的影响，结果发现过表达miRNA-346会导致细胞的增殖分化能力减弱，与前期研究结果一致，当然其在体内对肠神经细胞的作用还有待于进一步研究。
综上所述，本研究初步建立了小鼠神经前体细胞体外培养和纯化的方法，寻找到单细胞悬液的最佳制备方式，同时发现慢病毒的转染效率最高，转染最为稳定，过表达miRNA-346后细胞出现相应表型，表明该细胞可用于功能实验研究，可作为先天性巨结肠及其他肠神经系统功能发育异常性疾病机制研究的工具。
利益冲突 无
