以PI3K/Akt/mTOR信号转导通路为靶点，观察PI3K抑制剂LY294002和mTOR抑制剂RAD001对体外培养血管瘤内皮细胞增殖与凋亡的影响，并检测PI3K/Akt/mTOR信号轴中效应分子以探讨血管瘤消长的分子机制。
采用组织块结合酶消化法培养血管瘤内皮细胞、传代培养，并用第Ⅷ凝血因子相关抗原对其鉴定。待细胞处于对数生长期，使用无血清培养孵育48h行同步化处理后，分别加入RAD001、LY294002及RAD001＋LY294002作为干预组，加入完全内皮细胞培养基作为空白对照组。以上4组继续孵育24h后收集细胞，采用蛋白免疫印迹方法检测各组细胞p-Akt、p-mTOR、p-ERK及p-eIF4E蛋白的表达，流式细胞仪检测各组细胞的周期分布及凋亡率，分析p-Akt、p-mTOR、p-ERK及p-eIF4E蛋白的表达水平与血管瘤内皮细胞周期及凋亡变化的相关性。
1．RAD001、LY294002及RAD001＋LY294002干预24 h后，内皮细胞凋亡率分别为(13.80±1.73)%、(15.03±1.05)%、(36.06±2.67)%，较对照组(3.90±0.20)%有明显升高，差异具有统计学意义(t＝－9.82，－18.03，－20.82，P<0.01)，且RAD001＋LY294002组凋亡率显著高于对照组、LY294002组、RAD001组(t＝－20.82，－12.12，－12.7，P<0.01)；G0/G1期细胞比例分别为(74.29±1.59)%、(74.57±0.59)%、(82.28±3.01)%，较对照组(67.15±1.49)%有明显升高，差异具有统计学意义(t＝－5.67，－8.02，－7.79，P<0.01)，且RAD001＋LY294002组高于对照组、LY294002组、RAD001组(t＝－7.79，－4.35，－4.06，P<0.05)。2.蛋白免疫印迹检测显示，RAD001干预后，p-Akt、p-ERK、p-eIF4E蛋白表达分别为(0.75±0.04)、(0.54±0.08)、(1.50±0.34)，较对照组(0.43±0.08)、(0.27±0.04)、(0.84±0.17)增加，差异具有统计学意义(t＝－6.13，－5.49，－3.03，P<0.05)；p-mTOR(0.40±0.04)比对照组(0.77±0.07)明显降低，差异具有统计学意义(t＝7.91，P<0.01)。LY294002干预后，p-Akt、p-ERK、p-eIF4E、p-mTOR蛋白表达分别为(0.31±0.08)、(0.26±0.04)、(0.78±0.18)、(0.42±0.05)，与对照组比较，蛋白表达有一定下降趋势，但差异无统计学意义(t＝2.01、0.23、0.41、6.75，P>0.05)；RAD001＋LY294002干预后，p-Akt、p-ERK、p-eIF4E、p-mTOR蛋白表达分别为(0.32±0.09)、(0.23±0.04)、(0.50±0.13)、(0.27±0.03)，与对照组比较，p-eIF4E、p-mTOR蛋白表达下降，差异有统计学意义(t＝2.77、10.97，P<0.05)，p-Akt、p-ERK蛋白表达差异无统计学意义(t＝1.70、1.10，P>0.05)，与LY294002组，p-mTOR蛋白表达下降，差异有统计学意义(t＝4.42，P<0.05), p-Akt、p-ERK、p-eIF4E蛋白表达无统计学意义(t＝－0.15、0.92、2.16，P>0.05)，与RAD001组比较，均有明显降低，差异具有统计学意义(t＝7.37、6.47、4.75、4.87，P<0.01)。
mTOR抑制剂RAD001可引起p-Akt、p-ERK及p-eIF4E的负反馈激活；RAD001＋LY294002对体外培养血管瘤内皮细胞的干预效果优于单独使用RAD001或LY294002，且可避免RAD001引起的负反馈激活。
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PI3K/Akt/mTOR信号通路的某些组分的突变可引起细胞转化、调控肿瘤细胞的存活、增殖及迁移。前期研究表明PI3K/Akt/mTOR信号轴中效应分子在婴幼儿增生期血管瘤的表达明显高于消退期，提示PI3K/Akt/mTOR信号通路在血管瘤的演变中起重要作用[1,2,3]。本研究拟以血管瘤血管内皮细胞体外培养为模型，以PI3K/Akt mTOR信号转导通路为靶点，观察PI3K抑制剂LY294002和mTOR抑制剂RAD001对体外培养血管瘤内皮细胞增殖与凋亡的影响，检测PI3K/Akt/mTOR信号轴中的效应分子p-Akt、p-mTOR、p-ERK及p-eIF4E，以探讨血管瘤消长的分子机制，为以PI3K为靶点的临床血管瘤治疗提供实验依据。
血管瘤标本取自1例9个月龄女性患儿腰背部血管瘤，因瘤体较大且生长迅速，经保守治疗无效后，家属要求手术切除，标本的使用已征得家属同意。RPMI1640培养基、胎牛血清由美国HyClone公司生产，兔抗人第Ⅷ凝血因子相关抗原抗体由博士德公司提供，Recombinant Human FGF-basic由美国PEPROTECH公司生产，RAD001、LY294002由美国selleck生物科技有限公司生产，DMSO、Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒及彩虹245广谱蛋白Marker由北京索莱宝科技有限公司提供，TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)由美国Amersco公司生产，兔抗人p-Akt1/2/3(Ser473)抗体(sc-33437)、兔抗人p-ERK1/2(Tyr204)抗体(sc-101761)、兔抗人p-mTOR(Ser2448)抗体(sc-101738)及羊抗人p-eIF4E(Ser209)抗体(sc-12885)由美国Santa Cruz公司生产。
采用组织块结合酶消化法培养血管瘤内皮细胞、传代培养，并用第Ⅷ凝血因子相关抗原对其鉴定。待细胞处于对数生长期，使用无血清培养孵育48h行同步化处理后，分别加入RAD001、LY294002及RAD001＋LY294002作为干预组，加入完全内皮细胞培养基作为空白对照组。以上4组继续孵育24h后收集细胞，采用蛋白免疫印迹方法检测各组细胞p-Akt、p-mTOR、p-ERK及p-eIF4E蛋白的表达，流式细胞仪检测各组细胞的周期分布及凋亡率，分析p-Akt、p-mTOR、p-ERK及p-eIF4E蛋白的表达水平与血管瘤内皮细胞周期及凋亡变化的相关性。
血管瘤内皮细胞经同步化处理及药物干预24h后，用胰蛋白酶消化细胞制成细胞悬液转移至15 ml离心管中，调整细胞浓度为5×105～1×106个/ml，低速离心机1 000转(离心半径13.5 cm)离心5 min后弃去上清液；用预冷的PBS吹散洗涤细胞1～2次，离心机1 000转离心5 min后弃去上清液，加入500 μl预冷的70%冰乙醇，吹打混匀后4 ℃冰箱过夜；离心机按上述转速及时间离心，弃去乙醇使用PBS冲洗细胞2次，加入50 μl RNase-A，置于水浴箱中37 ℃孵育30 min，然后加入200 μl PI染色液，迅速避光转移至4 ℃冰箱中反应15 min，1 h内上流式细胞仪检测。
将血管瘤内皮细胞消化制备成细胞悬液(细胞浓度为5×105～1×106个/ml)，转移至15 ml离心管中，低速离心机1 000转离心5 min，完成后弃去上清液；用预冷的PBS洗涤细胞2次，离心后将上清液完全弃尽，将细胞重悬于200 μl Binding Buffer中，加入10 μl Annexin V-FITC和10μl PI，轻轻摇晃混匀，避光室温反应15 min，再加入300 μl Binding Buffer，混匀后在1 h内用流式细胞仪检测。
采用SPSS19.0统计学软件进行统计学分析，实验数据用
±s表示，采用单因素方差分析，检测水准α＝0.05。
RAD001、LY294002及RAD001＋LY294002干预24 h后，G0/G1期细胞比例分别为(74.29±1.59)%、(74.57±0.59)%、(82.28±3.01)%，较对照组(67.15±1.49)%有明显升高，差异具有显著统计学意义(P<0.01)，且RAD001＋LY294002组高于对照组、LY294002组、RAD001组，差异有统计学意义(P<0.05)。(图1)
RAD001、LY294002及RAD001＋LY294002干预24 h后，内皮细胞凋亡率分别为(13.80±1.73)%、(15.03±1.05)%、(36.06±2.67)%，较对照组(3.90±0.20)%有明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)，且RAD001＋LY294002组凋亡率明显高于对照组、LY294002组、RAD001组，差异有统计学意义(P<0.01)。(图2)
蛋白免疫印迹检测显示，RAD001干预后，p-Akt、p-ERK、p-eIF4E蛋白表达分别为0.75±0.04、0.54±0.08、1.50±0.34，较对照组0.43±0.08、0.27±0.04、0.84±0.17增加，差异均有统计学意义(P<0.05)；p-mTOR(0.40±0.04)较对照组(0.77±0.07)明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)。LY294002干预后，p-Akt、p-ERK、p-eIF4E、p-mTOR蛋白表达分别为0.31±0.08、0.26±0.04、0.78±0.18、0.42±0.05，与对照组比较，蛋白表达有一定下降趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)；RAD001＋LY294002干预后，p-Akt、p-ERK、p-eIF4E、p-mTOR蛋白表达分别为0.32±0.09、0.23±0.04、0.50±0.13、0.27±0.03，与对照组比较，p-eIF4E、p-mTOR蛋白表达下降，差异有统计学意义(P<0.05)，p-Akt、p-ERK蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)，与LY294002组比较，p-mTOR蛋白表达下降，差异有统计学意义(P<0.05)，p-Akt、p-ERK、p-eIF4E蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)，与RAD001组比较，均有明显降低，差异有统计学意义(P<0.01)。(图3)
血管瘤是婴幼儿最常见的肿瘤之一，由血管瘤内皮细胞异常增殖引起，这也意味着针对血管瘤内皮细胞的增殖与凋亡的调控能够影响血管瘤的增生与消退。当前，肿瘤细胞的发生、发展、侵袭及转移被证明与某些细胞内信号通路的异常激活有关，因此，针对各种信号通路与血管瘤发生、发展及消退间的联系等相关方面的研究成为了新的热点。目前VEGF/VEGFR信号通路、Notch信号通路、PI3K/Akt/mTOR信号通路、MAPK/ERK信号通路均被发现在血管瘤内皮细胞中有表达并参与了其中的调控[4,5,6]。其中，PI3K/Akt/mTOR信号通路及MAPK/ERK信号通路的激活能够上调VEGF、HIF-1α、bFGF等血管生成因子的产生[7,8]，而这些因子均能够促进血管瘤增生，因而这两条通路与血管瘤内皮细胞的关系也显得尤为密切。本实验中，p-Akt、p-ERK、p-eIF4E及p-mTOR这些PI3K/Akt及MAPK/ERK信号通路中的关键信号分子都被证明在体外培养的血管瘤内皮细胞中存在有表达。
近年来，随着分子靶向治疗研究的不断兴起，越来越多的靶向药物伴随着这些研究得以开发。mTOR信号分子因其位于PI3K/Akt信号通路的中心位置，且与肿瘤细胞增殖、分化、凋亡的密切联系，针对其抑制剂的开发及临床研究也变得格外受人关注。RAD001是雷帕霉素的衍生物，为mTOR特异性抑制剂，由瑞士诺华公司研发。RAD001与mTOR相结合进而形成无活性的复合物，该复合物可负性调控mTOR活性，进而导致细胞停滞于G1期并阻断mRNA的翻译，最终抑制癌细胞生长并促使其凋亡[9]。由于RAD001较雷帕霉素拥有更好的水溶性、耐受性及药理毒理学特性，被欧洲药品管理局(EMEA)批准作为免疫抑制剂治疗肾脏、心脏移植引起的急性排斥反应，被美国食品药品监督管理局(FDA)认证为二线药物治疗晚期肾癌、肺癌[10]。本实验中，通过RAD001干预体外培养血管瘤内皮细胞，G0/G1期细胞比例较对照组高(P<0.01)，细胞总凋亡率较对照组高(P<0.01)；提示RAD001能将血管瘤内皮细胞阻滞于G0/G1期，并诱导其凋亡，它的作用机制可能是RAD001与mTOR的FRB域特异性结合，形成复合物后使mTOR无法向下游底物传送信号，抑制了4EBP1及PIS6K的表达，延缓了关键mRNA的翻译，最终使细胞周期难以向S期转变，停滞于G0/G1期并触发血管瘤内皮细胞凋亡。
LY294002为经典的PI3K特异性抑制剂，理论上可靶向阻断PI3K/Akt通路的信号传导，因此有重要的临床应用价值。LY294002早于上世纪九十年代就已被人工合成，可与PI3K的催化亚基P110特异性结合，抑制PI3K诱导其底物PIP2转化为PIP3，PIP3为重要的第二信使，PIP3无法转化使得Akt无法得到激活，最终抑制肿瘤细胞的增殖[11]。本实验中，LY294002对体外培养血管瘤内皮细胞干预后，细胞凋亡率较对照组高(P<0.01)，G0/G1期细胞比例较对照组高(P<0.01)，提示LY294002可能通过下调PI3K活性，抑制Akt表达，阻滞细胞由G1期向S期转化，促使血管瘤内皮细胞凋亡。
目前，雷帕霉素及衍生物CCI-779、RAD001、AP23573等多种mTOR抑制剂已被应用临床前和临床试验中，虽然这些药物都被证实存在有较大的抗肿瘤及免疫抑制特性，但是单独使用mTOR抑制剂在临床试验中往往难以达到预期的药效[12]。最新研究表明雷帕霉素及其衍生物在靶向抑制mTOR的过程中，解除了S6K1对IRS-1的遏制作用造成mTOR上游分子Akt的反馈激活[13]；通过mnk介导，可引起mTOR下游分子eIF4E的反馈激活[14]；同时，信号通路之间既相对独立又存在有一定联系，PI3K/Akt信号通络与MAPK/ERK信号通路间就存在有串扰(cross-talk)现象[15]，这种现象的关键是PI3K/Akt信号通路与ERK之间存在相互抑制作用，靶向抑制mTOR可引起由PI3K介导的ERK反馈激活[16]。上述因单独使用mTOR抑制剂引起的负反馈激活现象已在肺癌、乳腺癌、大肠癌、前列腺癌等的体外细胞培养或动物移植模型中发现[11,12,13,14]，但血管瘤内皮细胞中是否存在这种负反馈机制还尚未得到证实。本实验中，体外培养血管瘤内皮经RAD001干预后，Western blot结果显示，p-mTOR蛋白表达降低(P<0.01)，但p-Akt、p-ERK及p-eIF4E蛋白表达升高(P<0.05)，说明在血管瘤内皮细胞中存在有靶向抑制mTOR使Akt、ERK、eIF4E这些肿瘤细胞生长信号关键分子激活的负反馈机制，这种负反馈激活机制可能解释了上述在临床试验中单独使用mTOR抑制剂无法达到预期疗效，很多肿瘤患者对雷帕霉素及其类似物并不敏感这一现象。同时靶向抑制mTOR反馈激活Akt、ERK及eIF4E说明PI3K/Akt/mTOR信号通路并非线性传递，其中存在有负反馈激活机制及其与MAPK/ERK通路的串扰机制。
肿瘤细胞的发生、增殖、侵袭往往伴随多种信号分子的异常调控，单一使用分子靶向抑制剂干预往往无法取得理想的治疗效果[17]，本实验中单独使用LY294002及RAD001调控血管瘤内皮细胞，虽然都能够不同程度的将细胞周期阻滞于G0/G1期且加速细胞的凋亡，但是单独使用LY294002调控对p-Akt、p-ERK、p-eIF4E及p-mTOR蛋白表达的影响并不明显(P>0.05)，而单独使用RAD001调控，在特异性抑制p-mTOR蛋白表达的同时，会引起上述的p-Akt、p-ERK及p-eIF4E蛋白表达升高。联合使用通路抑制剂可产生协同、放大效应，克服单独用药的局限性，减少甚至逆转耐药性的产生[18,19]，根据这一思路，本研究组联合应用RAD001＋LY294002干预血管瘤内皮细胞。细胞凋亡率较RAD001组及LY294002组明显升高(P<0.01)，G0/G1期细胞比例较RAD001组及LY294002组高(P<0.05)；Western blot结果显示，RAD001＋LY294002组p-Akt、p-ERK、p-eIF4E的蛋白表达与对照组比较，p-eIF4E、p-mTOR蛋白表达下降(P<0.05)；与LY294002组比较，p-mTOR蛋白表达下降(P<0.05)；与RAD001组相比，p-Akt、p-ERK、p-eIF4E、p-mTOR蛋白表达均明显下降(P<0.01)。表明联合用药较单独使用RAD001及LY294002对体外培养血管瘤内皮细胞的抑制作用更为明显并且能够克服RAD001所导致的负反馈激活现象，同时也说明了PI3K在这一负反馈机制中可能存在有介导作用。
综上所述，体外培养血管瘤内皮细胞中存在有p-Akt、p-ERK、p-mTOR及p-eIF4E的表达，RAD001、LY294002可通过干预PI3K/Akt/mTOR信号通路调控细胞周期，促进细胞凋亡。单独应用RAD001可出现PI3K/Akt及MAPK/ERK通路中关键信号分子Akt、ERK及eIF4E的活化，存在有负反馈激活机制，联合应用PI3K抑制剂LY294002可抵消这一机制，并对血管瘤内皮细胞的抑制作用更为明显。提高对mTOR反馈机制的认识，研究与血管瘤增生相关信号通路的分子机制，并寻找具有最大化抗血管瘤效用的药物联用方案，不仅能使我们对血管瘤发病机制的认识更为深刻，同时还可以为临床上治疗血管瘤提供新的思路。
利益冲突 无
