验证苯扎氯胺制作的先天性巨结肠症动物模型是否存在肠道炎症并探索上述炎症规律。
采用0.1%-30 min苯扎氯胺液包绕SD大鼠肠管制作先天性巨结肠症动物模型。18只SD大鼠遵循随机原则采用随机数字表法平均分为对照组、苯扎氯胺组。分别于术后第7、14、21天采用免疫组织化学检测对照组、苯扎氯胺组肠管C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)、肿瘤坏死因子α(turner necrosis factor α，TNF-α)的表达，采用酶联免疫吸附测定对照组、苯扎氯胺组血清CRP、TNF-α表达水平。
对照组、苯扎氯胺组大鼠在实验期间均存活，未出现大鼠死亡。术后第7、14、21天免疫组织化学结果证实对照组、苯扎氯胺组肠管CRP、TNF-α表达阳性；苯扎氯胺组肠管CRP、TNF-α表达强度自黏膜层向肌层方向均逐渐减弱，且随时间延长逐渐增强。酶联免疫吸附测定术后第7、14、21天苯扎氯胺组血清CRP表达水平(×103 ng/ml)分别为1.94±0.31、1.18±0.23和2.45±0.42，对照组CRP表达水平分别为0.21±0.22、0.31±0.24和0.18±0.19，组间各时间点比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；酶联免疫吸附测定术后第7、14、21天苯扎氯胺组TNF-α表达水平(×102 ng/ml)分别为1.92±0.10、2.05±0.12和2.28±0.16，对照组TNF-α表达水平分别为1.74±0.09、1.82±0.07、1.78±0.09，组间各时间点比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。
苯扎氯胺制作先天性巨结肠症动物模型存在肠道炎症。
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先天性巨结肠症(Hirschsprung’s disease，HSCR)是小儿最常见的先天性肠神经疾病，发生率为1/5 000活产儿，目前其发病机制为迷走神经嵴细胞在胚肠迁徙障碍[1]。作为目前HSCR主要的治疗手段，手术切除病变肠管虽可挽救生命，但约1/3 HSCR患儿会遗留污粪、大便失禁等，影响生长发育甚至危及生命[2]。肠神经嵴前体细胞能增殖、迁移，分化形成神经元亚型并与内源性肠神经网路整合参与修复肠神经系统，细胞移植已成为HSCR研究邻域的热门方向[3,4]。
Sato等[5]利用苯扎氯铵(benzylammonium chloride，BAC)剔除神经节细胞制作HSCR动物模型。尽管BAC化学剔除肠肌间神经节细胞程度还存在争议，国内外已有将上述动物模型用作细胞移植平台的报道[6,7,8]。我们在前期动物模型实验研究中发现，BAC动物模型表现为类HSCR症状即食欲下降、腹胀，剖腹发现存在苍白狭窄处理肠段、位于其近端扩张肠段及其中储留的干燥粪便；BAC处理术后第14天动物模型肠管与周围肠管及网膜广泛粘连，肠道全层尤其黏膜层严重充血肿胀，甚至处理术后第28天时上述炎症样改变仍存在[9]。另外，肠道炎症能通过诱导型一氧化氮合酶选择性引起肠神经元凋亡，而一氧化氮合酶抑制剂能阻断肠神经元凋亡[10]。因此，BAC动物模型可能存在肠道炎症并选择性引起肠神经元凋亡进而影响细胞移植效能。
C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)在炎性肠病如克罗恩病时升高，可作为炎症反应的预测因子和标志物[11]。肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor，TNF-α)是机体炎症反应的主要标志之一，在胃肠道等黏膜免疫系统中是一种有效的促炎症细胞因子，与消化系疾病如溃疡性结肠炎、克罗恩病等的发生密切相关[12]。本研究旨在验证BAC制作的HSCR动物模型是否存在肠道炎症并探索上述肠道炎症变化规律。
18只250 g左右SPF级Sprague-Dawley(SD)雌性大鼠均由西安交通大学医学部动物实验中心提供，生产许可证批号：SCXK(陕)2017-003。本实验由西安交通大学医学部生物医学伦理委员会审批通过(2018-2148)。
BAC(Sigma，SAINT 164 LOUIS，USA，#76857)；酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒：CRP(上海酶联生物科技，#m1002999)、TNF-α(上海酶联生物科技，上海，中国，#m1002859)。一抗：CRP(Abways Technology，USA，#CY5352)、TNF-α(Abways Technology，USA，#CY3826)。
本实验中18只SD大鼠采用随机数字表法平均分为对照组和苯扎氯胺组。
参考参考文献[9]，选择0.1%-30 min BAC，现用现配。
术前单只分笼喂养12 h，禁食不禁水；按100 g/0.4 ml剂量给予10%水合氯醛麻醉后常规备皮、碘伏消毒腹部操作区域；中下腹2 cm纵形切口，探寻双侧输卵管后下方的远端结肠并提至腹外；避开肠系膜血管丛，沿肠管方向游离出长约1 cm戳孔穿入2根棉签，垫高并固定后依序穿入双层无菌塑料条、无菌滤纸条；4～5 min滴加数滴BAC保持滤纸湿润30 min，避免BAC污染其他部位及腹腔；温生理盐水仔细冲洗腹腔后关腹，腹壁清洁消毒后分笼喂养；无菌生理盐水浸润包绕肠管的无菌滤纸条30 min作为对照。
麻醉满意后快速剖胸心脏取血2 ml，4 ℃ 3 000 r/min离心10 min(离心半径27 cm)，分离上层血清。取上述血清采用ELISA试剂盒在FLUOstar Omega多功能酶标仪(BMG LABTECH，S/N 415-2687，GER)下检测实验对照组、苯扎氯胺组SD大鼠CRP、TNF-α水平，严格按照ELISA试剂盒说明书操作。
断椎法处死苯扎氯胺组及对照组SD大鼠，固定后剖腹取出实验处理及对照肠段；常规脱水、浸蜡、包埋并制作成切片备用。取上述切片采用免疫组织化学的方法检测CRP、TNF-α的表达，操作步骤谨遵说明书。
实验节点设置为术后第7、14、21天；每个实验时间点对照组、苯扎氯胺组SD大鼠数量均为3只。
本实验数据均以(均数±标准误)表示，应用SPSS13.0统计学软件进行数据分析，采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
本研究中对照组、苯扎氯胺组SD大鼠在实验期间均存活。两组SD大鼠在剖腹术后第3天精神状态表现为眼无神、微睁，行动迟缓，对外界刺激反应迟钝；营养状况表现为被毛蓬乱无光、食欲下降、食量较术前明显减少、体重减轻。术后第7天对照组SD大鼠同术前无异，而苯扎氯胺组SD大鼠除上述精神状态、营养状况无改善外，还表现为类少神经节细胞症症状即明显腹胀及大便排出困难。术后第14天苯扎氯胺组SD大鼠腹胀加重，大便排出障碍，剖腹发现清亮腹水存在伴肠管浆膜层与周围组织粘连，BAC处理肠段苍白狭窄，其近端肠段扩张肥厚且大量干燥灰白肠内容物潴留而其远端肠管空虚，此外还发现肠道全层尤其黏膜层严重充血水肿。我们前期实验通过肠神经节/神经节细胞量化比较已证实0.1%-30 min-苯扎氯胺组SD大鼠肠神经节/神经节细胞数量在术后第7～84天间保持稳定，可用于制作HSCR动物模型[9]。
尽管术后第14天对照组SD大鼠在同术前精神状态、营养状况无明显区别，但免疫组织化学结果显示纵肌层及浆膜层CRP、TNF-α表达阳性(图1)，而黏膜、黏膜下层及环肌层无CRP、TNF-α阳性表达。
免疫组织化学结果显示术后第7、14、21天苯扎氯胺组SD大鼠肠管CRP、TNF-α表达均为阳性，与对照组不同，其黏膜、黏膜下层CRP、TNF-α表达阳性强度明显强于纵肌层及浆膜层(图2, 图3, 图4)。另外，苯扎氯胺组SD大鼠肠管黏膜、黏膜下层CRP、TNF-α表达阳性强度随时间延长而逐渐增强。
术后第7、14、21天苯扎氯胺组SD大鼠血清CRP表达水平(×103 ng/ml)分别为1.18±0.23、1.94±0.31和2.45±0.42，表达呈现逐渐增强的趋势；对照组SD大鼠的表达水平分别为0.21±0.22、0.31±0.24、0.18±0.19，组间各时间点比较，差异均有统计学意义(P<0.05，表1)
两组不同时间点CRP、TNF-α表达水平(n＝9)
两组不同时间点CRP、TNF-α表达水平(n＝9)
| 组别 | 时间点 | CRP(×103 ng/ml) | TNF-α(×102 ng/ml) |
|---|---|---|---|
| 苯扎氯胺组 | 术后第7天 | 1.18±0.23a | 1.92±0.10a |
| 术后第14天 | 1.94±0.31a | 2.05±0.12a | |
| 术后第21天 | 2.45±0.42a | 2.28±0.16a | |
| 对照组 | 术后第7天 | 0.21±0.22 | 1.74±0.09 |
| 术后第14天 | 0.31±0.24 | 1.82±0.07 | |
| 术后第21天 | 0.18±0.19 | 1.78±0.09 |
注：与对照组术后相同时间比较，aP<0.05
术后第7、14、21天苯扎氯胺组SD大鼠血清TNF-α表达水平(×102 ng/ml)分别为1.92±0.10、2.05±0.12和2.28±0.16，表达也呈现逐渐增强的趋势；对照组SD大鼠的表达水平分别为1.74±0.09、1.82±0.07、1.78±0.09，组间各时间点比较，差异均有统计学意义(P<0.05，表1)。
本研究中，免疫组织化学方法检测出BAC制作的HSCR动物模型肠管中炎性因子CRP、TNF-α表达阳性，提示存在肠道炎症；进一步ELISA检测量化比较动物模型血清CRP、TNF-α表达水平发现炎性因子CRP、TNF-α随时间延长而逐渐增加，提示上述肠道炎症持续存在且其程度呈现强化趋势。
肠神经嵴前体细胞(enteric neural crest-derived cells, ENCCs)移植已成为研究HSCR细胞替代领域的热点之一[13,14,15]。国内外相关研究者一直尝试应用基因敲除、BAC等方法制作具有稳定、与移植细胞具有较好"兼容性"的移植载体。一方面，已有的研究证实HSCR患儿及基因敲除动物模型肠管存在肠道菌群失调，Ward等[16]使用高通量测序的方法检测HSCR患儿肠道菌群发现HSCR患儿肠道双歧杆菌和乳酸杆菌数量明显减少，而拟杆菌门、厚壁菌门和变形菌数量增多；Pierre等[17]发现HSCR基因敲除小鼠动物模型存在菌群失调和细菌入侵现象。除菌群失调外，还有文献进一步报道HSCR患儿/基因敲除动物模型肠道环境还存在防御屏障(杯状细胞功能、表面粘液)和神经递质表达的改变，这些均可能导致肠道炎症[18]。另一方面，经典观点认为BAC能够选择性剔除肠神经丛中神经节细胞，可以用于制作HSCR动物模型[5]。尽管BAC处理后化学剔除肠肌间神经丛神经节细胞程度目前还存在争议，BAC制作HSCR动物模型进行ENCCs移植已得到较大范围的应用[6,7,8]。但BAC制作HSCR动物模型有无上述肠道菌群失调、肠道炎症尚需明确。我们前期采用BAC制作HSCR动物模型[9]，通过大体观察发现：①HSCR动物模型存在腹水；②肠管与周围组织严重粘连，且浆膜层明显充血水肿；③处理段近端肠管剖开后发现储留大量干燥灰白粪便，且肠管尤其黏膜层严重充血水肿。Holle[19]也发现BAC处理术后第21天部分肠段黏膜也存在轻微炎症合并糜烂、黏膜层覆盖粘液和碎屑以及顶端绒毛受损等改变。本研究不仅明确BAC制作HSCR动物模型肠管存在肠道炎症；发现苯扎氯胺组SD大鼠肠管黏膜、黏膜下层CRP、TNF-α表达阳性强度明显强于纵肌层及浆膜层提示肠道炎症可能来源于肠道黏膜层并向纵肌层及浆膜层扩散；还进一步通过量化的方法比较发现上述肠道炎症会随时间呈现强化趋势。
我们进一步查阅文献发现，肠道炎症可通过诱导型一氧化氮合酶选择性诱导肠神经元凋亡，而一氧化氮合酶抑制剂能够阻断神经元凋亡[10]。结合本研究结果推测可知，BAC制作HSCR动物模型存在肠道炎症可诱导肠神经元凋亡，不仅能够加深对BAC制作HSCR动物模型的认识，且对后续ENCCs移植实验有重要意义。BAC制作HSCR动物模型肠管存在的持续且强化的肠道炎症可能协同参与了BAC选择性剔除肠神经丛中神经元的过程，是为经典观点的一种补充。但尚需进一步研究证实肠道炎症在制作HSCR动物模型过程中的参与程度。另外，必须考虑BAC制作HSCR动物模型肠管存在的持续且强化的肠道炎症能够诱导动物模型肠管残余肠神经元及移植后ENCCs衍生的新生神经元凋亡，在后续采用ENCCs移植于BAC制作HSCR动物模型肠管的过程中必须充分重视持续且强化的肠道炎症对移植实验的影响，并采取有效的针对措施减轻/消除肠道炎症，从而减弱/免于肠道炎症对肠神经元的细胞毒性，避免移植过程中ENCCs凋亡，最终提高ENCCs移植修复ENS效能。
当然，本研究还存在以下不足，如在BAC制作HSCR动物模型的过程中尚需进一步明确BAC与肠道菌群失调、肠道炎症有无直接/间接关联；除一氧化氮合酶途径外，肠道炎症有无其他途径/通路对肠神经元或ENCCs施加影响；肠道炎症发生过程中涉及多种炎症因子，有必要进一步筛选并加深对其的认识。此外，BAC制作HSCR动物模型可能设计到神经发生、神经元功能性/代偿性肥大增生、BAC长期作用及肠道炎症，因此还需要进一步研究明确上述可能存在的因素对本研究的影响。最后，异位组织迁移、原位神经逆向分化及横向分化也需要待排。
利益冲突 无
