采用双向电泳质谱分析筛选梅克尔憩室患儿和无肠道畸形儿童尸检小肠的差异蛋白。
取无痛性便血梅克尔憩室患儿憩室顶端全层组织和无肠道畸形儿童尸检小肠组织。分别提取组织总蛋白、双向电泳分离、MALDI-TOF质谱分析、PubMed蛋白质序列检索，筛选得到黏膜差异蛋白。采用免疫组织化学法对憩室组38例患儿及对照组16例组织筛选出来的差异蛋白进行验证。
筛选出11项表达差异大于3倍的蛋白，质谱分析及PubMed检索出5项蛋白得分高。其中，膜联蛋白A2（Anx-A2）、表皮生长因子受体（Egfr）低表达，细胞角蛋白9（Cyk9）和人类组织相关抗原I （MHC-I）在憩室异位黏膜高表达，血红蛋白被认为是憩室血管内残留。免疫组织化学显示Anx-A2在憩室基底层弱表达，对照组阳性表达；Cyk9在憩室壁黏膜层高表达，对照组阴性表达；MHC-I在憩室壁黏膜层阳性表达，对照组为弱阳性表达。
Anx-A2低表达及Cyk9、MHC-I高表达可能与梅克尔憩室发病有关。
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梅克尔憩室是常见的先天性畸形，人群发生率2%~4%，其终身发病率为4%~6%[1,2,3,4]。梅克尔憩室常有异位组织，这些异位组织通常具有分泌功能，诱发憩室炎症、出血及穿孔[1]。梅克尔憩室出现并发症时病情复杂，不易确诊、极易误诊[2,3]。目前，梅克尔憩室的临床诊断常需要锝99扫描、双重气囊肠镜、血管造影及腹腔镜等检查，尚无快速筛查方法[4,5,6]。
梅克尔憩室是具有分泌功能的异位组织致病的一种疾病[7]。临床上，子宫内膜异位症亦为具有生理功能的异位组织病变，外周血筛查"内异症差异蛋白"已进入临床试验阶段[8,9,10]。我们学习其研究方法，筛选梅克尔憩室的差异蛋白，从蛋白质层面探索该病的相关机制，为建立筛查梅克尔憩室病做基础研究。
双向电泳患儿病例选择：无痛性血便患儿，男，6岁2个月，病程9 d，术前锝99检查示下腹部放射性物质浓聚，开腹探查见憩室距离回盲部55 cm，憩室长4 cm，基底3 cm，类圆锥形，内有凝固血块。行肠切除肠吻合术，憩室矢状位对半切开，其中一半送病理检查，剩余部分4℃生理盐水保存。术后诊断为梅克尔憩室出血，病理检查示憩室尖端及中段异位胃黏膜。剩余部分生物柜内双蒸水漂洗后液氮保存。对照组病例：车祸伤儿童尸检小肠。免疫组织化学患儿选择：38例梅克尔憩室患儿，其中30例梅克尔憩室出血，7例梅克尔憩室炎，1例梅克尔憩室穿孔。对照组16例，尸检2例、外伤肠切除6例、肠套叠远端的无畸形小肠8例。排除标准：单纯探查到并切除的梅克尔憩室，梅克尔憩室肠套叠、梅克尔憩室束带肠梗阻。
蛋白提取试剂盒及BCA蛋白浓度测定试剂盒购于碧云天公司，IPG胶条试剂购于Bio-RAD，蛋白银染试剂盒购于凯基生物公司，垂直平板电泳套装、等电聚焦仪器、扫描仪及扫描控制分析软件为Amersham Biosciences公司，胶条Bruker质谱分析仪分析。质谱分析仪由Bruker公司生产。Cyk9、人类组织相关抗原及Anx-A2单克隆抗体购于Abcam，二抗购于北京康为公司，DAB显色盒购于康为公司。免疫组织化学Nikon-RL1成像。
肠道黏膜处理：梅克尔憩室离体后，生理盐水浸泡10 min，剖开憩室切取全层组织。无菌台下4℃林格氏液冲洗，无菌纱布沾干，反复12次。蛋白提取定量：实验组及对照组黏膜液氮处理，用RIPA裂解液提取总蛋白。4℃环境下碾磨匀浆离心，BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。电泳：预制IPG胶条上样1 mg （24 cm pH3~10）。50V 13 h水化，200V 1 h逐渐增加电压500V 1 h，1 000V 1 h，达到10 000V聚焦。胶条平衡后垂直SDS-PAGE电泳，电压80V 30 min，电压100V至溴酚蓝指示剂达到胶条底部边缘停止。每组相同实验参数重复3次。
选择相似度具有统计学意义的蛋白，染色和切胶（生物技术公司）：凝胶置于50%甲醇-10%醋酸固定2 h，ddH20脱固定液，硝酸银染色。使用UMAX Powerlook扫描进行扫描。采用Phoretix 2D v2003分析软件对得到的图像进行数据处理（蛋白质点的检测、背景扣除、量化和点匹配，对蛋白点进行编号，在对比的两组胶上取共同点数码合成虚拟胶，比较其差异点。依据蛋白编号、峰值和量值，自动匹配，选择出灰度值相差3倍及以上编号蛋白。1.5 mm切胶笔切下蛋白质点用于下游实验。质谱分析：切下来的蛋白点予酶解，MALDI-TOF/TOF质谱仪进行质谱分析肽质量指纹参数及图谱并与PubMed肽链检索对比得出得分。
组织取出后立即用生理盐水漂洗，部分取材，组织尽量选择靠近憩室顶端。4%多聚甲醛固定组织，3 d内脱水石蜡包埋。每季度统一用4 μm石蜡切片，脱蜡、水化、枸橼酸抗原修复、3%H2O2阻酶、小牛血清封闭，孵育：滴加一抗（最适浓度Anx-A2兔单抗1:100，Cyk9兔单抗1:150，MHC-I鼠单抗10 ng/ml）覆盖所切的组织。保湿盒中4℃过夜。孵育加二抗，最适浓度羊抗兔1:1 500，兔抗鼠1:800。DAB显色、复染、分化、返蓝及中性树脂封片。封片后常规高倍显微镜下观察、分析及成像。
采用GraphPad Prism （绘制医学图表）V5.01软件处理数据。免疫组化结果和术中诊断结果采用¦Ö2检验，P<0.05为差异有统计学意义。
依据蛋白电荷和分子量大小差异，采用双向电泳技术分离黏膜蛋白，获得梅克尔憩室和儿童尸检小肠黏膜蛋白凝胶。染色后图像分析对比，面积3倍差异以上位点11处，其中憩室组高表达7处，低表达4处（图1）。
从图片对比出的位点分别切胶，酶解后质谱分析蛋白或肽的氨基酸序列并同PubMed检索分析，分析结果如下表（表1）。Mass：匹配蛋白的分子量。PI：蛋白所对应的等电点；gi：基因序号；Socre：提交的序列和搜索出的序列之间的相似分值，分数越高说明越相似，大于64分即P<0.05。11个位点中膜联蛋白A2，细胞角蛋白9，血红蛋白，主要组织相容性复合体I抗体，表皮生长因子受体复合物这5个位点的质谱分析匹配度及分值适于继续研究。5个位点分值小于64分：烯醇化酶3（enolase 3）、人绒毛膜促性腺激素2044989（hCG2044989）、中链性梳4（sex comb on midleg-like 4）、血红蛋白¦Á1珠蛋白链（hemoglobin alpha 1 globin chain）、血红蛋白相关的某蛋白（Chain A, T-To-Thigh Quaternary Transitions In Human Hemoglobin）。另有1个位点信息为表皮生长因子受体复合物异构体。
2-DE质谱分析和生物信息检索后分值较高的蛋白结果表
2-DE质谱分析和生物信息检索后分值较高的蛋白结果表
| 蛋白名称 | 分子量 | 等电点 | 基因序号 | 相似分值 | 实验组表达 |
|---|---|---|---|---|---|
| 膜联蛋白A2（Annexin A2，Anx-A2） | 32 600 | 7.13 | gi|119597993 | 142 | 低表达 |
| 细胞角蛋白9（Cytokeratin 9，Cyk9） | 62 320 | 7.17 | gi|435476 | 114 | 高表达 |
| 血红蛋白（Hemoglobin，Hg） | 14 141 | 7.09 | gi|4378748 | 110 | 高表达 |
| 主要组织相容性复合体I抗体（MHC-I antigen，MHC-I） | 131 888 | 7.32 | gi|121495683 | 72 | 高表达 |
| 表皮生长因子受体复合物（Egfr Complex，Egfr） | 37 891 | 5.65 | gi|110590405 | 66 | 低表达 |
400倍镜下，Anx-A2在对照尸检小肠绒毛基底层及肌层有表达，主要为胞质及细胞间隙表达；但密度均匀同倍数显微镜下在憩室基底层及肌层低表达，染色阳性细胞数密度较对照组低。Cyk9在对照小肠绒毛细胞中表达，在肠绒毛基底部不表达；在憩室异位黏膜上皮层表达，在基底部细胞高表达；人类组织相关抗原在对照组黏膜低表达，在基底部高表达。在憩室全层高表达。表皮生长因子在对照组及憩室表达均低，差异不明显。两组Anx-A2统计学指标P=0.021，两组Cyk9统计学指标P=0.014，两组MHC-I统计学指标P<0.01。认为以上3个指标在对照组和憩室组的表达差别具有统计学意义（表2）。
两组Anx-A2 、Cyk9、MHC-I表达结果（例）
两组Anx-A2 、Cyk9、MHC-I表达结果（例）
| 组别 | 例数 | Anx-A2 | Cyk9 | MHC-I | |||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| + | - | + | - | ++ | + | ||
| 对照组 | 16 | 10 | 6 | 3 | 13 | 6 | 10 |
| 憩室组 | 38 | 11 | 27 | 21 | 17 | 30 | 8 |
注：MHC-I ++，黏膜、黏膜下层及肌层均有表达；+，仅基底部或肌层表达
临床有三类梅克尔憩室人群，除了术中探查，偶发无症状的梅克尔憩室人群。一类患者是以物理性梗阻为表现的梅克尔憩室束带、梅克尔憩室腹内疝、梅克尔憩室肠套叠，占37%；另一类为腹痛表现的梅克尔憩室炎及憩室、伴或不伴腹痛的血便、梅克尔憩室穿孔，占73%[6,11,12]。真正引起梅克尔憩室特异性生化改变的为后一类，同时也是最易误诊的一类。梅克尔憩室病的特异性在于其致病组织是有生物功能的胃黏膜为主的异位组织[7,11]。胚胎期7~9周未闭锁的胎卵黄管形成憩室，残留了胚胎期的迷走异位黏膜。异位黏膜在机体生长发育时活化，分泌盐酸、胃泌素等消化液及细胞因子至此发病。梅克尔憩室病变过程中，首先是梅克尔憩室异位黏膜所致的无菌性炎症、黏膜增生，炎症细胞、抗原提呈等细胞浸润[1,7]。然后，无菌炎症及自身消化侵及憩室固有血管，大量出血，伴感染时可出现腹痛。最后，当炎症波及憩室壁全层时可导致穿孔。同时，慢性炎症是癌症的"热区"[13]。
膜联蛋白(annexin, Anx)是一种钙离子依赖的磷脂结合蛋白，在细胞凋亡、血管生成等情况下发挥重要作用[14]。Anx-AⅡ在人胚胎期表皮中的表达随胚胎的发育逐渐增强，在成人期表皮中的表达明显高于胚胎期，Anx可能参与表皮分化的调控。这可能也是梅克尔憩室内壁通常有质韧感的原因。非常相似的是，在子宫内膜异位症患者子宫内膜中的Anx-A1及Anx-A2较非子宫内膜异位症的子宫内膜中低表达[8,15]。另外，文献显示Anx-A1低表达和腭裂有关[16]。Anx-A5低表达和尿道下裂有关[17]。
细胞角蛋白（cytokeratin，Cyk）又称为血清骨胶素，主要分布于上皮细胞，是角质细胞中的主要骨架蛋白，这种结构蛋白的主要功能是维持上皮组织的完整性及连续性。研究发现Cyk具有极高的保守性和组织分化特异性，与上皮细胞的增殖分化密切相关[18]。Cyk作为一种中间丝，存在于包括胃肠道黏膜上皮的所有上皮细胞中及部分非上皮细胞。Cyk在肿瘤和重度炎症中的表达会增高。以Cyk19标记肺癌细胞为代表，临床上Cyk家族是多种肿瘤的免疫组织化学标记物[19]。Cky9作为临床上明确的肿瘤蛋白家族中的一员，在梅克尔憩室的发病中可能介导了炎症及恶变的过程。
另外三个差异明显的蛋白：其一，主要组织相容性复合体抗体（MHC-）是炎症相关蛋白，对梅克尔憩室炎症不具特异性。由于无论梅克尔憩室是无菌炎症还是感染性炎症时均会有抗原提呈细胞浸润，抗原提呈细胞的细胞膜上MHC-可提取炎症区域的异体蛋白抗原，这是免疫学中探明的MHC-在炎症时表达的原因。其二，表皮生长因子受体（Egfr）与器官的修复和肿瘤的发生发展有密切的关系，文献显示子宫内膜异位症中该因子明显增强[10,20]。但在本研究中由双向电泳分离出的蛋白示为表皮生长因子受体复合物有差异，但购置不到其抗体，故用表皮生长因子受体代替，在对照及憩室表达均极低，差别不明显，可能抗体选择也导致了验证阶段的偏差，也可更换抗体后进一步研究。其三，血红蛋白广泛存在与体内，出血时即会增加，认为是憩室标本血管内红细胞残留，故未进一步研究。
本实验在蛋白质组学层面探索梅克尔憩室病可能存在的特异性蛋白。Anx和先天性畸形及组织异位病关系密切、Cyk和炎症、肿瘤具有相关性，Anx-A2的低表达或缺失及Cyk9的高表达或激活可能特异性地参与了梅克尔憩室的病变。这些蛋白是在胚胎期就已经存在，还是发病后表达；这些特异性蛋白除了局部差异外，是否还提呈入血都需总结和深入研究。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
