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• 临床研究 •
神经母细胞瘤中Yes相关蛋白1的表达及其与药物敏感性关系的研究
中华小儿外科杂志, 2019,40(6) : 494-498. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0253-3006.2019.06.003
摘要
目的

初步探讨Hippo信号通路中Yes相关蛋白1(Yes-associated protein 1，YAP1)在儿童神经母细胞瘤(neuroblastoma，NB)组织中的表达，并分析其与临床病理参数和化疗药物敏感性的关系。

方法

应用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、免疫组织化学(IHC)法检测25例NB、7例节细胞神经母细胞瘤(ganglioneuroblastoma，GNB)和8例节细胞神经瘤(ganglioneuroma，GN)组织中YAP1的表达；应用IHC或PCR扩增测序法检测其中11例NB/GNB肿瘤标本化疗药物相关性分子靶标的表达或突变。

结果

YAP1的mRNA在NB/GNB中的相对表达量为2.369±1.420，明显高于GN的0.829±0.122，组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)；在NB/GNB中，YAP1的mRNA相对表达量与肿瘤的分期、危险度、Shimada组织学分型、病理分级、大小和是否发生淋巴结、骨髓、骨转移等有关(P<0.05)，与患儿的年龄、性别无关(P>0.05)。IHC结果提示，YAP1在Ⅲ～Ⅳ期NB/GNB中呈强阳性表达，在Ⅰ～Ⅱ期NB/GNB中呈弱阳性表达，在GN中呈阴性表达，与mRNA表达水平一致。共检测肿瘤标本化疗药物相关性分子靶标5个，包括：人切除修复交叉互补基因1(ERCC1)、DNA拓扑异构酶Ⅰ(TOPO I)、DNA拓扑异构酶Ⅱ A(TOPO Ⅱ A)、DNA修复蛋白O 6-甲基转移酶(MGMT)和CYP2C19*2。肿瘤标本化疗药物敏感性分子靶标ERCC1表达检测提示铂类敏感性较高占36.4%(4/11)，TOPO I、TOPO II A、CYP2C19*2的表达或多态性分别提示伊立替康/拓扑替康、蒽环类/依托泊苷、环磷酰胺敏感性较高占27.3%(3/11)，MGMT表达检测提示替莫唑胺/卡莫司汀/司莫司汀敏感性较高占63.6%(7/11)。分析YAP1的表达量与化疗药物的敏感性的关系发现：YAP1在环磷酰胺敏感性较低组的表达(3.251±1.349)明显高于敏感性较高组(1.307±0.298)，组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)；但未发现YAP1的表达量与铂类、伊立替康/拓扑替康、蒽环类/依托泊苷、替莫唑胺/卡莫司汀/司莫司汀敏感性相关(P>0.05)。

结论

YAP1的表达与NB的分期、危险度、Shimada组织学分型、病理分级、大小和转移相关，可能参与了NB/GNB的发生发展。且YAP1的表达与环磷酰胺药物敏感性相关，故其可能是NB/GNB环磷酰胺耐药的潜在治疗靶点。

引用本文: 李斯文, 王珊, 杨超, 等.  神经母细胞瘤中Yes相关蛋白1的表达及其与药物敏感性关系的研究 [J] . 中华小儿外科杂志, 2019, 40(6) : 494-498. DOI: 10.3760/cma.j.issn.0253-3006.2019.06.003.
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Hippo信号通路在细胞增殖、凋亡、分化和发展中起关键作用，Yes相关蛋白1(Yes-associated protein 1，YAP 1)是该通路下游的主要靶点之一，起转录共激活作用。在许多肿瘤中，Hippo信号通路的功能失调提高YAP1的表达，促进肿瘤发展，与肿瘤分期、分级、预后等相关[1,2]。而且YAP1与肝癌、结肠癌、非小细胞肺癌等肿瘤耐药相关[3,4,5]。

神经母细胞瘤(neuroblastoma，NB)是儿童最常见的颅外实体肿瘤，占儿童肿瘤的8%，占肿瘤死亡患儿的15%[6]。NB异质性强，一些肿瘤可不经治疗自发消退，但大部分肿瘤发病隐匿，早期即可出现远处转移，诊断时已为疾病晚期。根据国际神经母细胞瘤病理学分类，NB从形态学上分为NB、节细胞神经母细胞瘤(ganglioneuroma，GNB)和节细胞神经瘤(ganglioneuroma，GN)[7,8]。其中GN为良性肿瘤，NB/GNB为恶性肿瘤。尽管NB/GNB的治疗包括手术、化疗、放疗、造血干细胞移植和GD2抗体等多种综合治疗方法，化疗仍是主要的不可替代的治疗方法之一，特别是在高危NB/GNB中，具有提高长期生存率、降低复发率和诱导化疗提高手术切除率等重要作用。但化疗耐药往往是导致晚期患儿治疗失败的关键原因。目前研究已证实，药物相关性分子靶标是造成药物反应个体差异的重要原因之一[9]。通过检测药物相关性分子靶标，能够预测肿瘤敏感性化疗药物。因此，本研究首先检测YAP1在NB中的表达，分析其与临床病理参数的关系，再通过化疗药物相关性分子靶标检测，预测化疗药物的敏感性，进一步分析YAP1的表达与药物敏感性的关系，为NB/GNB寻找新的潜在治疗靶点。

资料与方法
一、一般资料

收集2013年1月至2017年6月在重庆医科大学附属儿童医院确诊的25例NB、7例GNB和8例GN的手术切除或手术活检标本。25例NB中，男14例，女11例；中位年龄3岁(22 d至11岁)。7例GNB中，男3例，女4例；中位年龄4岁(1.6～5岁)。8例GN中，男6例，女2例；中位年龄4岁(2.3～10岁)。所有患儿直接手术或手术活检前均未进行放化疗等干预。纳入研究NB的分期、危险度分组等参照2015版《儿童神经母细胞瘤诊疗专家共识》[10]。组织收集后分成两部分，一部分用于石蜡包埋，石蜡切片机切成4.5 μm组织切片备用，一部分立即置于－80℃冰箱保存。本研究通过了重庆医科大学伦理委员会审查[(2017)年伦审(研)第(40)号]。

二、主要试剂及仪器

TRIzol试剂盒(Life Thechnologies)、逆转录试剂盒(TaKaRa)、SYBR Green Ⅱ荧光染料(TaKaRa)、YAP1引物(上海生工公司)、β-Actin引物(上海生工公司)、兔YAP1单克隆抗体(美国Abcam公司)、免疫组织化学超敏二步法试剂盒(北京中杉金桥公司)、DAB显色试剂盒(北京中杉金桥公司)、CFX96 Cycler荧光定量PCR仪(美国BIO-RAD公司)、显微镜(Nikon E800，分析软件NIS-ELEMENtS br.3.0)。

三、方法
1.RT-qPCR法检测NB组织中YAP1基因mRNA的表达

采用TRIzol法提取NB组织总RNA，紫外分光光度计检测RNA浓度和纯度，参照TaKaRa逆转录试剂盒将RNA(1 μg)逆转为cDNA，逆转录体系为20 μl，采用SYBR GREEN荧光染料qPCR法分别扩增YAP1 cDNA(上游引物为5’-CCTGATGGATGGGAACAAGC-3’，下游引物为5’-GCACTCTGACTGATTCTCTGG-3’)，以β-Actin为内参照基因(上游引物为5’-AGACCTGTACGCCAACACAG-3’，下游引物为5’-GTACTTGCGCTCAGGAGGAG-3’)，在CFX96 Cycler荧光定量PCR仪上运行。每份标本设定3个复孔，实验重复3次，分别测定每个样品YAP1 mRNA的相对表达量值。

2.免疫组织化学法检测NB组织中YAP1蛋白的表达

石蜡包埋，4.5 μm连续切片，60℃烘烤后进行免疫组织化学实验。经脱蜡、枸橼酸钠抗原修复，3% H2O2室温孵育阻酶，0.5% BSA封闭，滴加兔YAP1单克隆抗体(1∶50稀释)，4℃过夜，经免疫组织化学试剂盒试剂1和试剂2作用后，DBA显色，苏木素复染，中性树胶封片后在光学显微镜下观察染色反应。YAP1表达阳性为胞核、胞质棕黄色颗粒沉着。

3.肿瘤标本化疗药物相关性分子靶标检测

11例Ⅲ～Ⅳ期NB的石蜡包埋组织标本送至上海复旦临床病理诊断中心，分别采用IHC、PCR扩增测序法检测药物相关性分子靶标的表达或突变。

四、统计学方法

实验所得数据用SPSS 20.0进行分析。计量资料结果用Mean±SD表示，组间两两比较采用独立样本t检验；计数资料间两两比较采用Fisher精确检验。以双侧α＝0.05为检验水准，P<0.05为差异有统计学意义。

结　果
一、NB不同病理参数组中YAP1的mRNA表达差异

YAP1的mRNA在NB/GNB中的表达(2.369±1.420)明显高于GN(0.829±0.122)，差异有统计学意义(P<0.05)。在NB/GNB中，Ⅲ～Ⅳ期的表达(2.711±1.360)，明显高于Ⅰ～Ⅱ期(0.887±0.115)；中高危的表达(2.711±1.360)，明显高于低危(0.887±0.115)；组织分化不良型(UFH型)的表达(3.451±1.169)，明显高于组织良好型(FH型)(1.287±0.554)；低分化/未分化的表达(2.817±1.403)，明显高于分化(1.226±0.599)；≥5 cm的表达(2.782±1.371)，明显高于<5 cm(1.131±0.653)；发生转移的表达(2.800±1.486)，明显高于未转移(1.650±0.985)，组间比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，但与患儿年龄、性别无关(P>0.05，表1)。

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表1

YAP1的mRNA表达量与神经母细胞瘤临床病理参数的关系

表1

YAP1的mRNA表达量与神经母细胞瘤临床病理参数的关系

病理参数例数YAP1表达量F值P值
病理学分类    
 NB/GNB322.369±1.42014.6730.000
 GN80.829±0.122  
INSS分期    
 Ⅰ～Ⅱ期60.887±0.1159.8090.000
 Ⅲ～Ⅳ期262.711±1.360  
危险度    
 低危60.887±0.1159.8090.000
 中/高危262.711±1.360  
Shimada组织学分型    
 FH型161.287±0.55411.4980.000
 UFH型163.451±1.169  
病理分级    
 分化91.226±0.5997.1510.000
 低分化/未分化232.817±1.403  
肿瘤大小    
 <5 cm81.131±0.6536.9940.000
 ≥5 cm242.782±1.371  
转移    
 是202.800±1.4863.0450.024
 否121.650±0.985  
性别    
 男172.075±1.4150.3930.218
 女152.703±1.398  
年龄    
 <1.5岁102.613±1.4720.0010.521
 ≥1.5岁222.258±1.417  

注：FH型，组织分化良好型；UFH型，组织分化不良型

二、免疫组织化学法检测NB组织中YAP1蛋白的表达

YAP1在Ⅲ～Ⅳ期NB/GNB中呈强阳性表达，在Ⅰ～Ⅱ期NB/GNB中呈弱阳性表达，在GN中呈阴性表达，组间比较，差异有统计学意义(P<0.05，图1)，与mRNA表达水平一致。

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图1
YAP1在各组织中的表达(DBA染色，×400)　A．GN；B.I期NB；C.Ⅲ期NB；D.Ⅳ期NB
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图1
YAP1在各组织中的表达(DBA染色，×400)　A．GN；B.I期NB；C.Ⅲ期NB；D.Ⅳ期NB
三、肿瘤标本化疗药物相关性分子靶标检测结果(表2)
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表2

化疗药物相关性分子靶标检测结果

表2

化疗药物相关性分子靶标检测结果

药物相关性分子靶标检测检测方法例数检测结果结果分析
ERCC1表达IHC11低表达4例，高表达7例低表达表示铂类敏感性较高，高表达表示对铂类敏感性较低
TOPO Ⅰ表达IHC11低表达8例，高表达3例低表达表示对伊立替康/拓扑替康敏感性较低，高表达表示对伊立替康/拓扑替康敏感性较高
TOPO ⅡA表达IHC11低表达8例，高表达3例低表达表示对蒽环类/依托泊苷敏感性较低，高表达表示对蒽环类/依托泊苷敏感性较高
MGMT表达IHC11低表达7例，高表达4例低表达表示对替莫唑胺/卡莫司汀/司莫司汀敏感性较高，高表达表示对替莫唑胺/卡莫司汀/司莫司汀敏感性较低
CYP2C19*2多态性PCR扩增测序11野生型3例，杂合子8例野生型表示对环磷酰胺敏感性较高，杂合子表示对环磷酰胺敏感性较低

肿瘤标本化疗药物敏感性分子靶标ERCC1表达检测提示铂类敏感性较高占36.4%(4/11)，TOPO Ⅰ、TOPO ⅡA、CYP2C19*2的表达或多态性分别提示伊立替康/拓扑替康、蒽环类/依托泊苷、环磷酰胺敏感性较高占27.3%(3/11)，MGMT表达检测提示替莫唑胺/卡莫司汀/司莫司汀敏感性较高占63.6%(7/11)。分析YAP1基因mRNA的表达与化疗药物敏感性的关系发现(表3)，YAP1在环磷酰胺敏感性较低组的表达(3.251±1.349)明显高于敏感性较高组(1.307±0.298)，差异有统计学意义(P<0.05)，而YAP1分别在铂类、伊立替康/拓扑替康、蒽环类/依托泊苷、替莫唑胺/卡莫司汀/司莫司汀敏感性较高组与较低组的表达差异均无统计学意义(P>0.05)。

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表3

YAP1表达量与化疗药物敏感性的关系

表3

YAP1表达量与化疗药物敏感性的关系

药物的敏感性例数YAP1表达量F值P值
铂类    
 敏感性较高42.900±2.13410.2550.818
 敏感性较低72.618±1.102  
环磷酰胺    
 敏感性较高31.307±0.2988.3270.005
 敏感性较低83.251±1.349  
伊立替康/拓扑替康    
 敏感性较高33.717±1.2030.2760.176
 敏感性较低82.347±1.422  
蒽环类/依托泊苷    
 敏感性较高32.627±1.2360.7910.904
 敏感性较低82.755±1.606  
替莫唑胺/卡莫司汀/司莫司汀    
 敏感性较高72.703±1.6090.7470.960
 敏感性较低42.752±1.368  
讨　论

Hippo信号通路在哺乳动物中起控制器官大小、调节细胞增殖和凋亡的作用。近年来，许多研究表明，该通路的失调会导致下游靶基因YAP1在肺癌、胃癌、软组织肉瘤、神经胶质瘤等多种肿瘤中高表达，被当作癌基因，与肿瘤的分期、分级、转移等相关[11,12,13,14]。此外，YAP1作为肾上腺皮质肿瘤和肝癌等肿瘤无病生存率和总生存率的独立预后因素，过表达与肿瘤预后差相关[15,16]。本研究结果提示，YAP1在NB/GNB肿瘤组织中高表达，并且与肿瘤的分期、危险度、Shimada组织学分型、病理分级、大小和转移相关，可能参与了NB/GNB的发生发展，为国内首次初步研究Hippo-YAP1信号通路与NB的关系，可能为NB的治疗寻找到新的药物分子标志物。但本研究样本量偏小，后续将进一步扩大样本量，再次验证实验结果，并深入研究Hippo信号通路与NB生物学特性的关系，同时对患儿的长期生存率进行随访，分析YAP1在NB/GNB中的表达是否与患儿的预后相关。

尽管GD2抗体等免疫治疗提高了高危患儿的长期生存率，化疗仍是不可替代的治疗手段[17]。并且多药耐药往往是化疗反应差的主要原因之一，但具体的耐药机制尚不明确。研究表明，YAP1在非小细胞肺癌细胞中高表达促进厄洛替尼耐药[5]；在结肠癌细胞中高表达对5-氟尿嘧啶耐药，而YAP1抑制剂维替泊芬的运用能够逆转YAP1过表达的紫杉醇耐药[4,18]。本课题组前期研究发现，通过药物相关性分子靶标检测，能预测化疗药物的敏感性，且根据检测结果选择敏感药物能有效缩减瘤体、减少术前化疗疗程、减轻化疗副反应[19,20]。本研究初步通过检测11例Ⅲ～Ⅳ期NB/GNB常用化疗药物相关性分子靶标，预测其对药物的敏感性，发现这11例Ⅲ～Ⅳ期NB/GNB对铂类、伊立替康/拓扑替康、环磷酰胺的敏感性不高。进一步分析这11例Ⅲ～Ⅳ期NB/GNB的YAP1表达量与药物敏感性的关系，发现YAP1表达增高与环磷酰胺耐药相关，这为研究化疗药物耐药靶点提供了新的思路，但仍需在细胞和动物实验进一步验证。Yang等[21]通过体外和动物实验发现，YAP1能够促进NB的生长和顺铂耐药。本研究未发现YAP1与铂类等药物耐药相关，可能与检测药物敏感性的样本量较小相关，还需进一步扩大样本量进行研究。后期将收集化疗前后NB的标本，检测YAP1的表达是否随着化疗的改变而改变，更加直观地分析YAP1的表达与耐药的关系。

利益冲突

利益冲突　所有作者均声明不存在利益冲突

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