探讨在成肌分化过程中，组胺H3受体对外源性肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导的C2C12细胞炎症反应的作用，从分子角度阐明小儿尿道括约肌的发育和损伤修复过程对外源性炎症刺激的抵抗机制。
利用外源性TNF-α刺激小鼠C2C12成肌细胞分化各阶段，将分化0、3、6 d，分别记为D0、D3和D6阶段，在体外模拟小儿尿道括约肌发育和损伤修复过程中遭遇外源性感染的过程。实验分组为空白对照组、TNF-α组、TNF-α＋H3受体激动剂(methimepip，Met)组和TNF-α＋H3受体阻滞剂(cirpoxifan，CXP)组。采用CCK-8法和流式法检测各组分化过程中细胞的生长活性和凋亡的影响；实时定量聚合酶链反应(quantificational real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)检测细胞炎症小体蛋白NLRP3以及早中晚细胞分化标志物MyoD1、Myogenin、Myosin-2的表达；ELISA法检测炎性因子IL-1β的分泌。
C2C12细胞分化过程中，CCK-8法检测显示TNF-α和TNF-α＋CXP会导致各分化阶段细胞的生长活性明显降低(P<0.05)，而TNF-α＋Met组的细胞活性与对照组之间的差异无统计学意义(P>0.05)。TNF-α和TNF-α＋Met均不引起细胞凋亡63.3%，TNF-α＋CXP导致61.3%的D6阶段细胞发生凋亡。TNF-α诱导D3和D6阶段细胞炎症小体蛋白NLRP-3的mRNA表达分别增加101%和90%，Met降低TNF-α诱导的NLRP3 mRNA达33%和37%，而CXP增加TNF-α诱导的NLRP3 mRNA达23%和24%。TNF-α使D3和D6阶段细胞的分化标志物MyoD1 mRNA降低38%和22%, Myogenin mRNA降低29%和35%，Myosin-2 mRNA降低42%和33%；Met进一步降低TNF-α刺激下的D3和D6阶段细胞各标志物达23%和31%，23%和26%，31%和36%，而CXP增加TNF-α刺激下的D3和D6阶段细胞各分化标志物达40%和25%，35%和31%，50%和21%。ELISA显示TNF-α诱导D6细胞分泌IL-1β的分泌量为49.7 pg/ml，Met降低了IL-1β的分泌量，为37.9 pg/ml
TNF-α能诱导C2C12细胞发生炎症反应并抑制成肌分化过程；组胺H3受体可抑制TNF-α诱导的炎症反应并有序调控分化进程，由此证明小儿尿道括约肌发育和手术后损伤修复过程在遭遇外源性炎症刺激时，组胺H3受体可抵抗外源性炎症反应的作用来维持细胞正常的发育和修复。
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外源性感染是小儿术后常见的并发症，所致的炎症刺激可明显导致术后的尿道修复、发育和尿道括约肌再生过程的减缓[1]，外源性感染的分子机制尚无明确报道。目前认为几乎所有的炎症反应均由各种炎症小体活化后产生的一系列炎症介质和免疫细胞趋化因子作用所致[2]。核苷酸结合寡聚化结构域样受体3(nucleotide -binding oligomerization domain like receptor family，pyrin domain-containing 3，NLRP3)炎症小体是天然免疫的重要组分和炎症反应的核心，与婴幼儿时期的固有免疫、感染和炎症等多种小儿疾病密切相关[3]。目前NLRP3炎症小体在各种细胞的活化、调控机制以及与临床疾病的关系还在实验阶段，尚无统一标准[4]。组胺H3受体主要参与人体的神经传导、肌肉收缩和胃肠道疾病的神经调节等，是否参与细胞的炎症反应调控尚不明确[5]。有文献报道适当浓度的肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)可诱导小鼠C2C12成肌细胞发生炎症、自噬和凋亡等[6]，而发生的炎症是由NLRP3炎症小体介导的[7]。我们在前期研究中发现在小儿尿道横纹肌和小鼠成肌干细胞C2C12分化过程中有组胺H3受体的表达，且H3受体对细胞具有监控、抑制过度增殖与分化、降低肌细胞收缩时胞质中钙离子浓度和降低肌肉收缩等功能[8,9]。本研究尝试用外源性TNF-α刺激小鼠C2C12成肌细胞分化成各阶段细胞，于体外模拟小儿尿道括约肌在发育和损伤修复遭遇外源性感染的过程，从分子角度探讨过程中组胺H3受体在小儿尿道括约肌发育和损伤修复过程中遭遇外源性感染时发挥的作用，为小儿尿道修复和抗感染治疗提供一定的参考。
将小鼠成肌细胞C2C12 (CRL-1772™，ATCC，美国)培养在37°C、湿润、二氧化碳含量为5%的培养箱中。培养液：①生长液为DMEM培养基500 ml内添加10%胎牛血清、1×104个单位的青霉素和链霉素、左旋谷氨酸；②分化液为DMEM培养基500 ml内添加1%胎牛血清，1×104个单位的青霉素和链霉素、左旋谷氨酸。传代：0.5 mmol/L的EDTA(含0.5%胰蛋白酶消化贴壁细胞)，按照1∶10的比例进行接种传代。
根据检测需要，将细胞接种到96孔板或者12孔板或者6孔板，1～4组为未分化细胞记为D0组，5～8组为分化3 d的细胞记为D3组，9～12组为分化6 d细胞记为D6组，并分别在各组细胞中依次加入培养液、TNF-α、TNF-α＋H3受体激动剂(methimepip，Met)和TNF-α＋H3受体阻滞剂(cirpoxifan，CXP)(表1)。
各分化阶段细胞的实验分组情况
各分化阶段细胞的实验分组情况
| 编号 | 组别 | 细胞诱导 天数(d) | 诱导物质 | ||
|---|---|---|---|---|---|
| TNF-α | Met | CPX | |||
| 1 | D0 | 0 | - | - | - |
| 2 | D0 | 0 | ＋ | - | - |
| 3 | D0 | 0 | ＋ | ＋ | - |
| 4 | D0 | 0 | ＋ | - | ＋ |
| 5 | D3 | 3 | - | - | - |
| 6 | D3 | 3 | ＋ | - | - |
| 7 | D3 | 3 | ＋ | ＋ | - |
| 8 | D3 | 3 | ＋ | - | ＋ |
| 9 | D6 | 6 | - | - | - |
| 10 | D6 | 6 | ＋ | - | - |
| 11 | D6 | 6 | ＋ | ＋ | - |
| 12 | D6 | 6 | ＋ | - | ＋ |
注：TNF-α，肿瘤坏死因子-α，作用浓度为10 ng/ml；Met，H3受体激动剂，作用浓度为100 nmol/L；CPX，H3受体阻滞剂，作用浓度为1 000 nmol/L
细胞培养液及配方购于美国Lonza公司；各引物购于芬兰Oligomer Oy公司；CCK-8试剂盒和Annexin V凋亡检测试剂盒购于美国BBI Life Sciences公司；Human IL-1cience试剂盒购于美国R&D Systems公司，TNF-α、组胺H3受体激动剂(methimepip，Met)购于美国SIGMA公司；组胺H3受体阻滞剂(cirpoxifan，CPX)购于美国Santa Cruz公司。
①实施操作的第一天(细胞接种)：细胞接种(共1～12组) 将细胞铺进96孔板中，每孔加入1.6×104个细胞，加入培养液培养细胞；②实施操作的第二天(细胞尚未分化)：将D0组分别加入等量对应浓度的培养液、TNF-α液、TNF-α＋thimepip液和TNF-α＋Ciproxifan液，12 h不过夜，然后收集细胞加入CCK-8液进行CCK-8检测，对D0组的操作结束，同时在这个阶段需将D3和D6组换分化液进行分化；③实施操作的第三天(细胞分化的第一天)：无操作处理；④实施操作的第四天(细胞分化的第二天)将D3和D6组所有细胞换分化液继续分化；⑤实施操作的第五天(细胞分化的第三天)：将D3组加入等量对应浓度的培养液、TNF-α液、TNF-α＋Methimepip液和TNF-α＋Ciproxifan液，12 h不过夜，然后收集细胞加入CCK-8液进行CCK-8检测，对D3组的操作结束；⑥实施操作的第六天(细胞分化的第四天)：将D6组换分化液；⑦实施操作的第七天(细胞分化的第五天)：无操作处理；⑧实施操作的第八天(细胞分化的第六天)：将D6组加入等量对应浓度的培养液、TNF-α液、TNF-α＋Methimepip液和TNF-α＋ Ciproxifan液，12 h不过夜，然后收集细胞加入CCK-8液进行CCK-8检测，对D6组的操作结束。
将C2C12细胞铺进6孔板中，每孔铺4×105个细胞；细胞长到80%时，加入分化液，诱导C2C12细胞分化，分化时间分别为0 、3和6 d，铺板并加入相应药品24 h后按流式凋亡检测试剂盒的操作说明进行流式检测，具体分组情况如下：①将细胞用胰酶消化，1 500 r/min离心5 min，去上清并收集细胞；②用500 μl PBS清洗1次，1 500 r/min离心5 min；③加入195 μl Binding Buffer(1x)，同时加入5 μl AnnexinV-FITC，室温闭光孵育30 min，离心去上清；④用200 μl Binding Buffer(1x)清洗一遍，离心去上清；⑤加入190 μl Binding Buffer(1x)，同时加入10 μl Propidium Lodide；⑥4 h内流式上机检测。
将C2C12细胞铺进12孔培养板中，每孔5×104个细胞，加入生长液增殖。48 h后将加入分化液分化，每24 h换一次分化液，按照时间点加入各药品。分别测量分化0、3、6 d的细胞中各分化标志物和炎症小体标志物mRNA的表达。
具体操作按说明书所述执行。RNA纯度和浓度用紫外分光光度仪测定，读取样品RNA溶液在260 nm和280 nm波长下的光吸收值，计算A260/A280比值，系统软件自动计算出RNA浓度(μg/μl)。
将提取的总RNA样本，抽提450 μg(约2～3 μl)至一个无菌的无核酸酶的EP管中，加入4 μl 5x iscript反应液，1 μl iscript逆转录酶，(15 μl-RNA样本体积)iscript去核酸酶蒸馏水，总反应体积20 μl，置入载有专门cDNA合成软件的加热仪器中合成cDNA。
取cDNA 2 μl、2×qRT-PCR SYBR MIX缓冲液(含dNTPs，Tag酶等)10 μl、上下游引物(5 pmol/μl)1 μl、去核酸酶蒸馏水7 μl加入qRT-PCR合成管中(总反应体积20 μl)，4 000 r/min离心2 min混匀后将放入qRT-PCR仪中进行目的片段的扩增。获取的qRT-PCR引物序列详见表2。
各检测标志物的引物序列
各检测标志物的引物序列
| 基因名称 | 引物序列 | 扩增 长度 | |
|---|---|---|---|
| 上游 | 下游 | ||
| MyoD1 | CCACTCCGGGA | AAAAGCGCAG | 109 |
| CATAGACTTG | GTCTGGTGAG | ||
| Myogenin | GAGACATCCCCC | GCTCAGTCCG | 106 |
| TATTTCTACCA | CTCATAGCC | ||
| Myosin-2 | GTCAGCACCAT | TTTGCCAAATCG | 117 |
| GTCTTATGGG | GGAAGAGTT | ||
| NLRP3 | ATTACCCGCCC | TCGCAGCAAAGA | 141 |
| GAGAAAGG | TCCACACAG | ||
| IL-1β | GCAACTGTTCCT | ATCTTTTGGGG | 118 |
| GAACTCAACT | TCCGTCAACT | ||
| PBGD | AGGTCGGTGTG | GGGGTCGTT | 101 |
| AACGGATTTG | GATGGCAACA | ||
使用ELISA试剂盒测量细胞培养液中的IL-1β表达：①IL-1β一抗预包被在96孔酶标板中，室温过夜，PBST洗涤3次、抛干；②加入收集的细胞培养液100 μl，室温2 h，PBST洗涤三次、抛干；③加二抗100 μl，室温2 h，PBST洗涤3次、抛干；④加链霉亲和素与辣根过氧化物酶100 μl，室温20 min，避光，PBST洗涤3次、抛干；⑤加底物A＋B按照1∶1混合成工作液100 μl室温20 min，避光；⑥加终止液50 μl 20 min，避光；⑦用ELISA检测仪测定450 nm波长OD值，并计算出P/N比值。
数据采用SPSS 17.0进行统计学处理，计量资料以Mean±SD表示，多组样本均数间比较采用方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。
与正常对照组细胞相比，TNF-α降低了C2C12细胞D0、D3、D6分化阶段的生长活性，分别为20.5%、29.8%、29.7%(P<0.05)；TNF-α＋Met对D0、D3、D6分化阶段细胞的生长活性无明显影响(P>0.05)。TNF-α＋CPX降低了D0、D3、D6分化阶段细胞的生长活性，分别为16.7%、40.3%、44.7%(P<0.05)。
C2C12正常对照组细胞在D0、D3、D6分化阶段的细胞凋亡率为6.7%～7.1%。与正常对照组细胞相比，TNF-α和TNF-α＋Met对各分化阶段细胞不会引起明显的凋亡(P>0.05)，而TNF-α＋CXP导致D6分化阶段29.9%的细胞发生中晚期凋亡，31.4%发生早期凋亡(P<0.05)(图1)。
C2C12细胞分化过程中，TNF-α诱导D3和D6阶段细胞炎症小体蛋白NLRP3的mRNA表达分别增加101%和90%(P<0.05)，Met降低TNF-α的诱导达33%和37%(P<0.05)，而CXP增加TNF-α诱导达23%和24%(P<0.05)。TNF-α使D3和D6阶段细胞的分化标志物MyoD1 mRNA降低38%和22%(P<0.05), Myogenin降低29%和35%(P<0.05)，Myosin-2降低42%和33%(P<0.05)；Met进一步降低TNF-α刺激下的D3和D6阶段细胞早中期标志物mRNA达23%和31%，23%和26%，31%和36%(P<0.05)，而CXP增加TNF-α刺激下的D3和D6阶段细胞各标志物mRNA达40%和25%，35%和31%，50%和21%(P<0.05)。
ELISA显示TNF-α诱导D6细胞分泌炎性因子IL-1β的量为49.7 nmol/L。Met降低TNF-α诱导的IL-1β分泌量为37.9 nmol/L(P<0.001)，而CXP增加TNF-α诱导IL-1β的分泌量为64.4 nmol/L(P<0.001)。
小儿尿道括约肌的发育和损伤修复过程如何对抗外源性感染引起的炎症刺激尚无明确结论，目前认为几乎所有的炎症反应均由各种炎症小体的活化和产生的炎症介质有关[1]。炎症小体是由胞浆内模式识别受体参与组装的多蛋白复合物，是天然免疫系统的重要组成部分[2,10]。NLRP3炎症小体作为NOD样家族的代表，参与病原体的多种免疫和炎症反应过程，由NLRP3蛋白、凋亡相关的斑点样蛋白和前体caspase -1组成，凋亡相关的斑点样蛋白连接上游的NLRP3和下游的前体caspase -1[11]。caspase -1是NLRP3炎症小体的效应蛋白，而前体caspase -1本身无催化活性，可通过自身催化激活成caspase -1，将无活性的促炎细胞因子IL-1β和IL-18的前体剪切加工为成熟的IL-1β和IL-18[12]。NLRP3炎症小体主要表达于中性粒细胞、巨噬细胞、单核细胞和树突状细胞，表达诱导炎症反应[13]。有文献报道适当浓度的TNF-α可诱导小鼠C2C12成肌细胞发生炎症、自噬和凋亡等[6]。而小鼠C2C12成肌细胞炎症的产生是由NLRP3炎症小体介导[7]。因此本研究用10 ngTNF-α对C2C12成肌细胞进行诱导，发现这个浓度对细胞的生长活性有一定影响，但没有明显增加细胞凋亡。随后我们发现TNF-α对细胞的生长抑制效应是诱导了NLRP3炎症小体的产生(NLRP3与IL-1β均显著增加)和抑制了分化进程(TNF-α使分化各期标志物表达明显降低)。
组胺是生物体合成的活性氨，参与机体免疫，生化等功能。到目前为止发现有4种受体，组胺H1、H2、H3和H4受体[5]。组胺H3受体是细胞的自我保护性受体，调控细胞的生理活动和功能在有序可控的正常范围，防止过度反应给细胞带来损伤[14,15]，如在大脑中，H3R负反馈调控组胺有序的合成和释放，调节胆碱能神经的可控传递[16]。我们的前期研究发现在小儿尿道横纹肌和小鼠成肌干细胞分化过程中，H3受体的表达量随着成肌分化过程成百倍的增加，当用药品外源性激活H3受体，可以使细胞的分化过程轻度减缓，减缓程度不随着加入的药品剂量增加而大幅增加；当细胞本身增殖分化不良时，加入的药品不能减缓分化进程；说明H3受体在分化过程有序监控细胞的正常增殖分化，防止细胞失控、增殖分化引起凋亡[8,9]。在分化成熟的肌细胞中，H3受体减少了细胞收缩时胞质中钙离子浓度(降低肌肉收缩功能)，减少程度随有效的阻滞剂指数浓度增加而先升高后降低，总体抑制率控制在5%～50%；并且在细胞静息状态，H3受体对胞质钙离子不发挥作用。由此推断H3受体的作用是保护性受体，监控细胞的可控收缩，防止过度收缩对细胞造成伤害，维持细胞稳定状态的功能[17,18]。
本研究在小鼠成肌干细胞C2C12分化过程中，用外源性TNF-α刺激各阶段细胞，体外模拟小儿尿道括约肌发育和损伤修复过程中遭遇外源性感染的过程。研究中用Met和CPX分别激活和阻滞H3受体，发现Met有降低TNF-α对炎症小体NLRP3和炎症因子IL-1β表达的诱导作用，同时减低了分化中的细胞各标志物的表达；而CPX使TNF-α对NLRP3和IL-1β的诱导增加，同时增加了分化中的细胞各标志物的表达。MET＋TNF-α对细胞的活性和凋亡无影响，但TNF-CPX导致大量细胞凋亡和坏死。C2C12细胞的分化过程是成肌细胞增殖融合的过程，当细胞遭遇外来炎症刺激时，作为保护性受体的H3受体被激活后，可使分化进程减缓来调动细胞能源抵抗炎症，降低细胞的炎症反应。但如果在这一过程中，H3受体功能被阻滞，将导致H3受体的监控功能关闭，细胞进入不受控的增殖分化过程，细胞对遭受的外界炎症刺激无法感知，导致炎症刺激不断扩散。当细胞自身能源耗尽，处于失控分化状态的细胞只能启动细胞凋亡机制或在TNF-α＋CPX组中发现大量细胞凋亡，而分化标志物的表达很高就是这个原因。本次研究再次验证了我们以往的论证，H3受体是细胞的保护性受体，能监控细胞的正常活动和生理功能[8,9]。
Met是高特异性的H3受体激动剂，受体亲活力PKi值为9，因此采用Met的最适浓度(激活效果最佳的最低浓度) 100 nmol/L可以最大限度激活H3受体而减少细胞副反应。CPX是H3受体阻滞剂，可以作用于H1、H2和H3受体，但对H3受体的亲和力最强，PKi为7.1，对H1、H2受体的PKi均小于5[19]。因此我们采用1 000 nmol/L的CPX进行实验，不会作用到C2C12细胞中的H1和H2受体。
综上所述，本研究首次尝试用外源性TNF-α诱导分化中的C2C12细胞发生炎症反应，探讨小儿尿道括约肌的发育和损伤修复过程中遭遇外源性感染时组胺H3受体是否可发挥作用。研究发现TNF-α能诱导C2C12细胞发生炎症反应并抑制其分化过程，而组胺H3受体抑制TNF-α诱导的炎症反应而使分化进程有序减缓，也再次证明了H3受体是细胞的保护性受体，监控细胞的正常活动和生理功能，防止细胞失控分化、过度收缩，抵御外源性炎症刺激，从而说明小儿尿道括约肌的发育和手术后损失修复过程遭遇外源性炎症刺激时，激活组胺H3受体可抵抗外源性的炎症反应，维持细胞正常的发育修复。我们在后续的研究中将继续对组胺H3受体在细胞的自噬、凋亡以及相关信号通路中的作用做进一步探讨。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
