通过观察肝移植术后DNA甲基化修饰的改变导致基因异常表达，探讨GITR基因甲基化水平与排斥反应的相关性。
收集95例肝移植术后发生排斥反应受者的外周血样本，采用MassArray飞行质谱分析系统检测GITR基因甲基化程度，并用流式细胞仪检测发生排斥反应前后T淋巴细胞上GITR的表达情况。
发生排斥反应前后T淋巴细胞上GITR的表达率分别为6.89%和22.14%，二者差异有统计学意义(P<0.05)。发生排斥反应前，GITR基因CpG单位的平均甲基化率为88%，发生排斥反应后GITR基因CpG单位的平均甲基化率为82%，二者差异有统计学意义(P<0.05)。发生排斥反应后，GITR基因平均甲基化率较排斥反应前降低，而其蛋白表达率则有所上升，两变量直线相关分析结果显示，两者之间呈负相关关系(r＝－0.88，P<0.05)。
肝移植受者发生排斥反应后，GITR基因CpG单位甲基化水平发生改变，这可能对排斥反应的发生发展有重要意义；GITR基因CpG单位的低甲基化改变可能与排斥反应的发生有关联性。
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肝移植术后排斥反应是由于受者免疫系统识别供者异体抗原引起的一系列免疫反应。尽管使用免疫抑制剂，欧洲肝移植受者术后急性排斥反应的发生率为10%～40%，慢性排斥反应发生率也达到了5%[1]；我国肝移植受者中仍有约60%的受者至少发生过1次急性排斥反应[2]，慢性排斥反应发生率达到了2.2%。严重的排斥反应可导致移植物破坏和功能丧失。目前，排斥反应的发生机制仍有待探索。糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子(TNF)受体相关基因(GITR)是一个有效的抗肿瘤治疗的免疫靶向分子，也被称为肿瘤坏死因子受体超家族成份18(TNFRSF18)[3]。GITR在调节T淋巴细胞免疫方面具有特殊的作用。GITR是共刺激TNF超家族分子受体家族中的第18个成员，是胸腺来源的CD4＋CD25＋调节性T淋巴细胞(Treg细胞)上的一个表面分子，属于I型跨膜蛋白。在人类基因组中，DNA甲基化是一种表观遗传修饰[4]，甲基化是指从活性甲基化合物上将甲基催化转移到其他化合物的过程。甲基化涉及重金属修饰、基因表达的调控、蛋白质功能的调节以及核糖核酸(RNA)加工[5], 1%-2%的人类基因组是CpG群，并且CpG甲基化与转录活性成反比。因此，本研究中我们探讨了GITR基因甲基化水平与肝移植术后排斥反应的相关性。
收集2010年1月至2013年12月在我院接受肝移植，且术后发生免疫排斥反应的受者外周血样本95例，从我院肝移植标本库中调出相应受者的发生排斥反应前的外周血样本。所有受者的排斥反应诊断均经病理活检确诊，诊断标准必须具备至少以下2点：(1)汇管区炎性细胞浸润，包括淋巴母细胞或活化的淋巴细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞；(2)门静脉或中央静脉内皮细胞下炎症；(3)胆管的炎症和损伤；(4)伴有肝功能受损的生化指标；所有病例均有2位高年资病理医师共同作出诊断。
甲基化聚合酶链反应(PCR)检测引物均由北京博淼生物有限公司合成：使用在线预测网站(http：//www.ebi.ac.uk/Tools/seqstats/emboss_cpgplot/)预测潜在CpG岛，未发现CpG岛。用sequenom® EpiDesigner程序设计引物方案，引物序列见表1。
GITR基因PCR甲基化引物序列
GITR基因PCR甲基化引物序列
| 引物名称 | 引物序列(5'→3') | 片段长度(bp) |
|---|---|---|
| 上游引物 | AGGAAGAGAGTATTATTGTGTTAGGAGATTTGGGG | 374 |
| 下游引物 | CAGTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGCTTCAAAATCTATTTTCTCAAACACTTTC |
去受者的外周血样本，用红细胞裂解液裂解去除不含DNA的红细胞，细胞核裂解液裂解白细胞释放出基因组DNA，然后用蛋白沉淀液选择性沉淀去除蛋白，最后纯净的基因组DNA通过异丙醇沉淀并重溶解于DNA溶解液。检验DNA结果稳定，OD260/OD280典型的比值达1.7～1.9，长度可达50～150 kb，提取DNA构建文库，放置于-80 ℃冰箱中保存。
首先，使用甲基化修饰试剂盒对提取的DNA进行处理，使未被甲基保护的C变成U。然后，使用特殊设计的引物(末端带有T7RNA聚合酶启动子序列)对修饰过的DNA样本进行普通PCR扩增。再将扩增产物放置于体外转录体系中，利用T7RNA聚合酶进行体外转录，获得对应的RNA产物。接着，在体系中添加RNaseA，利用其特性将RNA产物酶切成小片段，每个小片段包含1个或几个CpG位点。然后用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)检测反应产物，以确定样本每个CpG的相对甲基化程度。甲基化检测的质谱分析方法的原理是基于MALDI-TOF MS可以根据分子量的大小将不同的产物分离并根据质谱峰图进行相对定量。
采用IBM SPSS Statistics 19软件对数据进行统计处理，检验水准a＝0.05。两者之间甲基化率的比较采用χ2检验或Fish确切概率法，利用两变量直线相关检验分析GITR基因CpG甲基化程度与GITR表达关系。P<0.05为差异有统计学意义。
发生排斥反应时，T淋巴细胞上GITR的表达率为22.14%，较发生排斥反应前的6.89%明显增高，且差异有统计学意义(P<0.05，图1)。
A为发生排斥反应前，B为发生排斥反应后
采用MALDI-TOF MS检测反应产物，以甲基化率确定样本每个CpG的相对甲基化程度。GITR基因扩增子中包含15个CpG单位，如图2所示。两组190个样本中CpG单位总个数为2 850个，其中2 675个(占93.86%)CpG单位可被分析。可被分析的2 675个CpG单位中，56.67%的CpG单位平均甲基化率>85%，甲基化水平较高；15.86%的CpG单位平均甲基化水平低于75%，甲基化水平较低。应用双向聚类分析描绘两组中GITR基因15个CpG单位的甲基化率分布趋势图(图3)，结果表明，GITR基因各CpG单位呈现出不同水平的甲基化，如图4所示，发生排斥反应后的平均甲基化水平较移植前有所降低，其中CpG_1、CpG_2.3.4.5、CpG_6、CpG_8、CpG_13等位点的平均甲基化率的差异有统计学意义(P<0.05)。
发生排斥反应后，GITR基因平均甲基化率较排斥反应前降低，而其蛋白表达率则有所上升，两变量直线相关分析结果显示，两者之间呈负相关关系(r＝－0.88，P<0.05，表2)。
肝移植术后排斥反应中GITR基因甲基化与其蛋白表达的关系
肝移植术后排斥反应中GITR基因甲基化与其蛋白表达的关系
| 检测时点 | CpG单位的平均甲基化率(%) | 蛋白表达率(%) |
|---|---|---|
| 排斥反应前 | 88 | 6.89 |
| 排斥反应后 | 82 | 22.14 |
注：r＝－0.88，P<0.05
肝移植后排斥反应包括宿主抗移植物反应(HVGR)[6]和移植物抗宿主反应(GVHR)[7,8]。引起严重后果、甚至导致移植失败的主要是移植物抗宿主反应，移植物抗宿主反应是由移植物中的特异性淋巴细胞识别宿主抗原而发生的一种反应。Treg细胞在自身免疫耐受和免疫自稳中起着非常关键的作用，其在胸腺内发育成为一类独立的CD4＋T淋巴细胞亚群。
GITR是糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体家族相关基因或蛋白(受体)，能反转CD4＋CD25＋ Treg细胞的抑制作用[9,10]。CD4＋CD25＋Treg细胞属于T淋巴细胞亚群，在维持机体免疫自稳、调控免疫应答方面具有重要作用。在T淋巴细胞活化之后，CD4＋CD8＋Treg细胞上GITR的表达会明显提高，B淋巴细胞及巨噬细胞上也有部分GITR表达[11]。GITR与GITRL相结合后，通过增强T淋巴细胞激活、分泌细胞因子、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和转录因子NF-kB激活效应[12]、抑制CD4＋CD25＋Treg细胞的功能[13]等途径，加强效应性T淋巴细胞的激活，从而增强自身免疫，导致移植后排斥反应的发生。
DNA的甲基化与去甲基化经常发生在DNA序列上的CpG岛[14]，当CpG岛发生甲基化时，会导致染色质的浓缩，从而不利于转录因子与DNA的结合，通常与基因的沉默有关；相反，如果CpG岛发生去甲基化，则会导致染色质的疏松，从而增加目的DNA序列的易接近性，使得特异性转录因子可以更容易与其连接，通常与基因的活化相关。Pinney等[15]研究表明，非Cpg岛(CpA、CpT、CpC)也能影响到基因的表达，通过全基因组测序发现非Cpg岛的甲基化水平与mRNA转录成反比。我们采用MALDI-TOF MS分析技术对GITR基因的15个CpG位点进行分析，结果显示8个CpG位点呈现出不同的甲基化改变。将肝移植后发生排斥反应前后受者的血液样本进行比较，结果显示，发生排斥反应后GITR基因的CpG_1、CpG_2.3.4.5、CpG_6、CpG_8、CpG_13位点的平均甲基化率显著低于发生排斥反应前，提示该基因特异性CpG位点的低甲基化可能参与了排斥反应的发生，低甲基化可能活化了GITR基因，或增强了其染色体的不稳定性，从而促进了排斥反应的发生发展。
综上所述，通过对肝移植后发生排斥反应受者外周血GITR基因甲基化的筛查，我们发现其CpG_1、CpG_2.3.4.5、CpG_6、CpG_8、CpG_13位点甲基化水平发生了改变，这可能在排斥反应发生发展中起到一定的作用，为进一步探索CpG岛甲基化与排斥反应的相关性提供了依据。
