对比抗人T细胞兔免疫球蛋白(ATG-F)单次大剂量与多次低剂量给药在肾移植受者中的有效性和安全性。
采用前瞻性、开放性、随机对照研究，在19家移植中心入组280例首次肾移植受者随机分为2组：(1)单次大剂量给药组(SD组)：138例，术中移植肾恢复血流灌注前，单次静脉输注ATG-F 7～9 mg/kg；(2)多次低剂量给药组(MD组)：142例，术中移植肾恢复血流灌注前、术后1～4 d，静脉输注ATG-F 2 mg·kg－1·d－1。除ATG-F诱导之外，所有受者均采用他克莫司缓释胶囊、吗替麦考酚酯及激素的免疫抑制方案。受者访视点分别为术后第1、3、7、14、30、90、180、270、365天。根据治疗失败率对两种治疗方案进行非劣效性评价。主要疗效指标为术后12个月的治疗失败率，次要疗效指标为三种亚型急性排斥反应(AR)和移植肾功能恢复延迟(DGF)发生率，受者和移植物存活率，以及各时点血肌酐(SCr)水平。安全性评价指标为血液学检查变化和不良反应发生率。
SD组和MD组治疗失败率分别为17.24%和23.08%，非劣效检验证实SD组治疗失败率不劣于MD组。AR是导致治疗失败的主要原因，SD组AR发生率非劣于MD组(12.07%和21.37%)。SD组和MD组术后1年DGF发生率分别为12.07%和6.84%，差异无统计学意义(P＝0.1721)；两组受者存活率分别为96.55%和98.29%(P＝0.6714)，移植肾存活率分别为94.83%和98.29%(P＝0.2750)，以及两组间各时点SCr水平的差异均无统计学意义。两组总体不良反应发生率的差异无统计学意义。所有关注的不良反应中以感染最为多见，其次为血液学检查异常、肝肾功能异常、胃肠道反应。SD组和MD组外周血淋巴细胞在术后1 d大量减少，分别在术后1和3个月恢复至给药前水平，未见严重粒细胞减少症、红细胞减少症和血小板减少症。
ATG-F单次大剂量给药的有效性不劣于多次低剂量给药方式，且两组安全性相当。单次大剂量用药更方便、更经济。
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优化免疫抑制方案、减少移植物功能障碍及急性排斥反应(AR)的发生，是肾移植临床持续面对的挑战，采用诱导治疗进行强力免疫抑制并减少再灌注相关的炎症反应被证实是重要措施之一，尤其是对于免疫高风险者[1]。临床常用的免疫诱导制剂有抗淋巴细胞抗体、阿仑单抗(抗CD52细胞溶解性抗体)和白细胞介素2受体阻断剂[2]。抗人T淋巴细胞兔免疫球蛋白(商品例：ATG-Fresenius® S，2015年更例为Grafalon®，简称ATG-F)是用人体Jurkat细胞系的T淋巴母细胞免疫兔获得的多克隆免疫球蛋白。ATG-F可以通过补体介导的淋巴细胞杀伤作用诱导细胞凋亡、Fc受体介导的抗体依赖性细胞溶解、单核巨噬细胞系统的调理及继发性吞噬等作用，大量清除循环中的T淋巴细胞，进而抑制T淋巴细胞介导的免疫反应[3]。此外，ATG-F抑制T淋巴细胞增殖，减少粘附分子及炎症分子的表达，影响抗原提呈细胞和T淋巴细胞之间、内皮细胞与淋巴细胞之间的交互作用，还具有诱导树突状细胞凋亡及调节性T淋巴细胞的产生。这些机制使得ATG-F为基础的免疫诱导治疗在肾移植临床得已应用并取得良好效果[4]。关于ATG-F两种给药方式(单次大剂量与多次低剂量)优越性的比较在临床前瞻性研究中开展不多。本项目是对肾移植免疫诱导治疗时ATG-F两种给药方式的有效性及安全性进行评价，是国内首次进行的多中心随机对照研究(ClinicalTrials.gov Identifier: NCT02267512)，现报告如下。
(1)患有终末期肾脏疾病且适合进行肾移植手术；(2)受者年龄18～65岁，男女不限；(3)受试者计划接受ABO血型相符的首次同种异体肾移植；(4)峰值群体反应性抗体(PRA) < 50%；(5)育龄女性在肾移植手术前7 d内需符合妊娠试验阴性，且在整个研究期间以及研究结束后6周内以医学上认可的方法进行避孕；(6)受者能理解研究的目的及风险，愿意参加研究并给出书面的知情同意。
(1)已经接受过或正在接受肾脏以外的器官移植；(2)接受双肾移植的受者；(3)受者接受的移植为ABO血型不符或淋巴细胞交叉配型阳性；(4)移植手术开始时移植物的冷缺血时间大于24 h；(5)受者接受的是HLA完全相同的活体肾移植；(6)受者有ATG-F的禁忌证：已知对兔蛋白过敏者，血小板严重减少，以及细菌、病毒或霉菌感染尚未得到治疗控制者；(7)对他克莫司、大环内脂类抗生素、MPA(麦考酚酸类)或药物的辅药成分过敏；(8)经研究者判断，受者不太可能遵守研究的访视安排或受者曾经有过依从性不好的历史；(9)怀孕、哺乳期妇女，以及不愿接受避孕的育龄妇女；(10)受者有活动性肝病的证据(如丙氨酸转氨酶或天冬氨酸转氨酶≥2 *ULN)或有慢性活动性乙型肝炎或丙型肝炎；(11)肾移植受者或捐献者血清HIV阳性；(12)需要接受抗生素治疗的活动性全身性感染；(13)受者不能建立中心静脉通路或较大孔径的外周通路以供研究药物给药之用；(14)有不稳定的心血管疾病或入组6个月内发生过心肌梗塞；(15)患有恶性肿瘤或过去5年内曾有过恶性肿瘤的病史，已经得到成功治疗的非转移的皮肤基底细胞癌、鳞状细胞癌、宫颈原位癌除外；(16)受者具有医学或精神疾病，经研究者判断会影响依从性。
本研究自2013年5月16日至2015年12月17日，共纳入受者280例，在术前随机分为2组：(1)ATG-F单次大剂量给药组(single high dose, SD组)：术中移植肾恢复血流灌注前，给予ATG-F 7～9 mg/kg单次静脉输注；(2)ATG-F多次低规剂量给药组(multiple low dose, MD组)：术后1～4 d，静脉输注ATG-F 2 mg·kg－1·d－1。两组受者口服他克莫司缓释胶囊剂量为0.1～0.15 mg·kg－1·d－1，术后0～1个月将血他克莫司浓度维持在12～15 μg/L，术后2～3个月为8～12 μg/L，4个月后为5～8 μg/L。吗替麦考酚酯用药剂量：体重≥70 kg的受者为1.5～2.0 g/d，体重在50～69 kg的受者为1.5 g/d，体重≤49 kg的受者为1.0 g/d，每天分2次口服。
研究期为术后12个月内，随访时间节点分别为肾移植术后第1、3、7、14、30、90、180、270、365天，疗效指标包括安全性和有效性评价。
主要观察指标为治疗失败率，治疗失败定义为发生受者死亡、移植肾功能丧失或AR，以最先发生的事件进行分类，各组治疗失败率＝(受者死亡例数＋移植肾功能丧失例数＋发生AR例数)/各组受者总例数。次要观察指标为：临床诊断、经组织活检证实以及激素抵抗的急性排斥反应发生率，移植肾功能恢复延迟(DGF)发生率，以及受者和移植肾术后1年存活率，由血清肌酐(SCr)水平判定移植肾功能。
血液学改变及不良反应发生率，主要包括感染，肝、肾功能异常，胃肠道不良反应，恶性肿瘤，发热，以及过敏反应等。
所有的统计分析用SAS 9.4完成。针对计量资料的描述性统计主要包括以下内容：计算例数(缺失例数)、均数、标准差、中位数、下四分位数、上四分位数、最小值、最大值以及均数的95%可信区间；计数资料和等级资料计算频数与相对数。对两组间计量资料的比较，根据其是否符合正态分布，采用t检验或Wilcoxon秩和检验；两组间计数资料的比较，采用卡方检验或Fisher精确概率检验。对于组内变量前后变化的比较，采用配对t检验或Wilcoxon符号秩检验。对于本研究的主要疗效终点(两组间治疗失败率)，将采用非劣效检验，以单侧α＝0.025作为检验水准。除此之外，其他数据的统计检验都将使用α＝0.05的双侧检验(差异性检验)。P<0.05为差异有统计学意义。
19家中心共入组280例受者，最终276例受者进入全分析集(FAS)及安全集(SS)，其中SD组135例，MD组141例。233例完成临床试验的受者资料进入符合方案集(PPS)，其中SD组116例，MD组117例。两组受者在性别、年龄、术前肾脏替代治疗时间、供肾类型、供肾冷和热缺血时间、DGF发生率等方面均无统计学差异(P>0.05)，SD组受者的ATG-F用药总剂量以及单位体重用药剂量均显著低于MD组(P<0.0001，表1)。
接受抗人T淋巴细胞兔免疫球蛋白(ATG-F)单次大剂量与多次低剂量给药两组肾移植受者基本资料的比较
接受抗人T淋巴细胞兔免疫球蛋白(ATG-F)单次大剂量与多次低剂量给药两组肾移植受者基本资料的比较
| 组别 | 例数 | 性别(男/女) | 年龄(岁) | 术前肾脏替代治疗时间(月) | 供肾热缺血时间(min) | 供肾冷缺血时间(min) | DGF(有/无) | ATG-F服药总剂量(mg) | ATG-F单位体重服药剂量(mg/kg) |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| SD组 | 135 | 97/38 | 36.96±9.49 | 18.14±18.17 | 6.40±5.94 | 235.68±202.11 | 5/130 | 454.88±88.60 | 7.56±0.77 |
| MD组 | 141 | 104/37 | 35.63±10.23 | 21.31±21.30 | 5.47±6.73 | 219.11±174.47 | 1/140 | 582.30±118.34 | 9.76±0.98 |
| P值 | 0.722 | 0.265 | 0.205 | 0.229 | 0.469 | 0.196 | <0.0001 | <0.0001 |
注：DGF为移植肾功能恢复延迟
在233例进入PPS的受者资料中进行。116例SD组受者中，14例发生AR，4例死亡，2例移植肾失功，治疗失败率17.24%；117例MD组受者中，25例发生AR，2例死亡，治疗失败率23.08%，非劣效假设亦成立，SD组由治疗失败率体现的疗效不劣于MD组(表2)。AR是导致治疗失败的主要因素，SD组AR发生率有低于MD组的趋势(12.07%和21.37%)。
接受抗人T淋巴细胞兔免疫球蛋白(ATG-F)单次大剂量与多次低剂量给药两组肾移植受者治疗失败率的比较
接受抗人T淋巴细胞兔免疫球蛋白(ATG-F)单次大剂量与多次低剂量给药两组肾移植受者治疗失败率的比较
| 组别 | 例数 | 治疗失败率(%) | 受者死亡率(%) | 移植物功能丧失发生率(%) | 急性排斥反应发生率(%) | 治疗失败率的95%可信区间 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| SD组 | 116 | 17.24(20/116) | 3.45(4/116) | 1.72(2/116) | 12.07(14/116) | 10.86～25.36 |
| MD组 | 117 | 23.08(27/117) | 1.71(2/117) | 0 | 21.37(25/117) | 15.79～31.77 |
| πB-πA的单侧可信度为97.5%的可信区间(δ＝15%) | －4.44～∞ | |||||
| 非劣效检验统计量 | 3.98 | |||||
| 非劣效检验P值(单侧α＝0.025) | <0.0001 |
注：治疗失败率＝(受者死亡例数＋移植物功能丧失例数＋发生急性排斥反应例数)/接受肾移植的总受者例数×100%
SD组与MD组根据症状和体征判断的急性排斥反应发生率分别为12.07%(95%可信区间为6.76～19.42)和15.38%(95%可信区间为9.38～23.22)，两组差异无统计学意义(P＝0.4622，CHISQ检验)；根据组织活检证实的急性排斥反应发生率分别为2.59 %(95%可信区间为0.54～7.37)和5.13%(95%可信区间为1.90～10.83)，两组差异无统计学意义(P＝0.5049，连续校正CHISQ检验)；激素抵抗性急性排斥反应发生率分别为0(95%可信区间为0～3.13)和3.42%(95%可信区间为0.94～8.52)，两组差异无统计学意义(P＝0.1325，连续校正CHISQ检验)。
SD组与MD组受者的DGF发生率分别为12.07%(95%可信区间为6.76～19.42)和6.84%(95%可信区间为3.00～13.03)，两组差异无统计学意义(P＝0.1721，CHISQ检验)；术后1年受者存活率分别为96.55%(95%可信区间为91.41～99.05)和98.29%(95%可信区间为93.96～99.79)，两组差异无统计学意义(P＝0.6714，连续校正CHISQ检验)；移植肾存活率分别为94.83%(95%可信区间为89.08～98.08)和98.29%(95%可信区间为93.96～99.79)，两组差异无统计学意义(P＝0.2750，连续校正CHISQ检验)。SD组和MD组受者术后各访视点SCr水平的差异均无统计学意义(P>0.05，成组T'检验，表3)。
两组肾移植受者术后各时点血清肌酐(SCr)的比较
两组肾移植受者术后各时点血清肌酐(SCr)的比较
| 组别 | 例数 | SCr(mol/L) | ||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 术后1 d | 术后3 d | 术后7 d | 术后14 d | 术后30 d | 术后90 d | 术后180 d | 术后270 d | 术后365 d | ||
| SD组 | 116 | 524.89±262.20 | 244.33±209.26 | 179.53±173.51 | 182.21±164.20 | 148.96±148.16 | 129.41±112.73 | 111.62±31.05 | 117.21±51.58 | 139.80±129.22 |
| MD组 | 117 | 500.91±239.76 | 207.05±169.82 | 152.10±154.15 | 150.65±127.52 | 129.60±85.02 | 114.20±31.79 | 112.74±36.17 | 116.43±38.68 | 118.52±40.76 |
| P值 | 0.470 | 0.138 | 0.205 | 0.106 | 0.231 | 0.177 | 0.810 | 0.902 | 0.100 | |
从不良反应总体发生情况来看，研究中SS集的276例受者共有234例发生不良反应，其中SD组不良反应发生率为82.22%(111/135)，MD组为87.23%(123/141)，两组间不良反应发生率的差异无统计学意义(P>0.05)。在关注的不良反应中44例报告了与研究药物相关的血象变化(SD组发生率为17.78%，MD组为14.18%，P＝0.4150) ；药物相关的感染性疾病为54例(SD组发生率为18.52%，MD组为20.57%，P＝0.6680)；药物相关的肝功能异常19例(SD组发生率为8.15%，MD组为5.67%，P＝0.4170)；药物相关的肾功能异常24例(SD组发生率为5.93%，MD组为11.35%，P＝0.1101)；药物相关的胃肠道不良反应8例(SD组发生率为2.96%，MD组为2.84%，P＝1.0000)；药物相关性发热5例(SD组发生率为2.96%，MD组为0.71%，P＝0.341)。上述各种不良反应发生率在两组之间的差异均无统计学意义。
有95例(34.42%)受者发生严重不良反应，其中SD组发生率为33.33%(45/135)，MD组为35.46%(50/141)，两组间不良反应发生率的差异无统计学意义。严重不良反应主要为肺部感染，其中SD组发生率为13.33%(18/135)，MD组为12.06%(17/141)，两组间肺部感染发生率的差异亦无统计学意义。未见需要干预治疗的严重红细胞减少症、粒细胞减少症和血小板减少症。
SD组和MD组受者术后1 d外周血淋巴细胞计数较给药前(基线水平)减少，之后逐渐上升，分别于术后30和180 d恢复至基线水平。MD组术后3、7、30、180及365 d淋巴细胞计数低于同时点SD组水平(图1)。整个观察期，两组外周血中性粒细胞较基线水平未见减少，SD组术后1、3和7 d高于MD组水平(图2)。与给药前相比，两组于术后1、3和7 d血小板计数下降，SD组受者术后1和3 d血小板计数低于MD组(P<0.05)，但术后7 d回高于MD组(P<0.05) ，两组均于术后14 d均恢复至给药前水平并稳定于相同水平(图3)。两组受者平均红细胞计数在观察期内无明显变化，同一时点的两组间差异亦无统计学意义(P>0.05，图4)。
ATG-F在作为免疫诱导药物时，临床多推荐以1.5～3 mg/kg的剂量，给药数次，但近年来亦有对ATG-F单次大剂量(6～9 mg/kg)给药方式进行评价的报道[5]。研究发现与巴利昔单抗诱导治疗组相比，ATG-F单次大剂量(9 mg/kg)给药组的AR发生率明显降低，两组肾移植受者在感染、严重不良反应及术后1年受者和移植肾存活率方面接近[6]。与传统免疫抑制剂方案相比，联合使用大剂量ATG-F的肾移植受者术后AR发生率较低，而感染发生率及移植肾5年存活率相当，表明单次大剂量ATG-F的有效性和安全性是令人满意的[7]。另一项研究发现，与低剂量多次给药(1.5～3 mg/kg，共7～8次)相比，ATG-F单次大剂量(9 mg/kg)给药更有利于移植肾功能的早期恢复及长期存活，且未增加过度免疫抑制相关的严重感染及骨髓抑制发生风险[7]。
在血管吻合完成、移植物恢复血流灌注后，供者特异性致敏反应即开始启动，成为排斥反应的发生机制。从免疫学观点看，早期采取预防或调控措施比中途阻断这种致敏反应效果更好、更容易，亦有利于免疫耐受的建立。理论上讲在移植肾血管吻合前给予大剂量ATG-F，能迅速有效地清除移植肾再灌注触发的T淋巴细胞活化，从而早期发挥抗排斥反应作用。一项关于ATG-F的多中心、双盲、随机对照临床前瞻性研究发现，ATG-F单次大剂量给药(6 mg/kg)作为诱导治疗时，在1年观察期内显示出的有效性和安全性并不劣于低剂量多次给药(1.5 mg/kg，共4次)[8]。本研究则是在ATG-F中开展的，以治疗失败率作为反映疗效的主要指标并进行非劣性检验，结果提示ATG-F单次大剂量给药的疗效不劣于多次给药。有研究在以环孢素A为基础免疫抑制方案的肾移植受者中，观察了单次高剂量ATG-F诱导治疗的有效性和安全性，结果显示接受ATG-F单次大剂量给药(9 mg/kg)受者的AR发生率为11.3%，显著低于未行诱导治疗的受者(20.5%)[9]。本研究结果显示，尽管两组间AR发生率的差异尚未达到统计学意义，但单次大剂量给药组有低于多次给药组的趋势(12.07%和21.37%)。对于研究中的多次给药组AR发生率较高的问题，不能完全排除在进行AR临床诊断而非病理诊断时，可能存在着多中心之间诊断标准的差异，而这个问题的解决需要进一步扩大样本量，这也是我们今后的研究内容。此外，两组DGF发生率、术后1年受者和移植肾存活率、各随访时点SCr均处于相当的水平，这些结果充分证明ATG-F单次大剂量给药和多次给药相比，前者疗效是不劣于后者的。
尽管在临床研究中，研究者在判断某种不良反应的发生是否与研究药物时可能存在主观性偏倚，但研究中两种给药方式下的肾移植受者，其总体不良反应发生率是接近的，具体到研究中最多见的感染以及实验室检查异常、肝肾功能异常和胃肠道反应上看，两组发生率也接近，未见ATG-F特有的严重不良反应，这些结果表明两种给药方式的安全性是相当的。本研究发现SD组和MD组淋巴细胞在首次给药后即大量被清除，直到术后1和6个月才各自恢复至给药前水平，可见无论是单次大剂量给药抑或分次给药，对淋巴细胞的清除作用都是迅速、强大且较为持久的，这种由诱导治疗造成的机体免疫抑制状态为优化免疫抑制维持方案提供了时间窗。研究还发现无论何种方式给药，对循环中的红细胞数量均无明显影响，而中性粒细胞也未见明显减少。与多次给药相比，ATG-F大剂量单次给药时血小板数量下降较为迅速且短暂，两组受者术后14 d血小板数量均已恢复至给药前水平，并未发生严重的血小板减少症。这些血液学变化也解释了研究中未见需要药物干预的严重红细胞、粒细胞、血小板减少等骨髓抑制征象，可能是ATG-F大剂量单次给药并未增加感染风险的原因之一。
作为国内首次多中心前瞻性临床试验，本研究对肾移植术后1年内ATG-F大剂量单次使用的有效性和安全性与传统的低剂量多次给药方式进行了对比，结果证实ATG-F大剂量单次给药下的有效性和安全性均不劣于低剂量多次给药方式。研究显示与MD组相比，SD组的用药总剂量较少，提示潜在的药物经济学优势，但还需进一步证实。同时单次大剂量静脉输注ATG-F用药方便、无需频繁监测淋巴细胞或CD4＋/CD8＋细胞比值来观察疗效和调整剂量，是临床肾移植可供选择的免疫诱导方案之一。
