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目前组织活检是临床诊断急性排斥的金标准，但其具有创伤性，难以作为临床常规检测手段。而其他血清学标志物，敏感性和特异性都较差。由于器官移植也伴随着基因组的移植，因此供体来源的游离DNA(donor-driver cell-free DNA，ddcfDNA)可以在受体的外周血中检测到，大量研究表明，游离DNA(cell-free DNA，cfDNA)可以作为最新的指示移植器官健康状态的生物标志物，具有无创、灵敏和实时等检测优势。通过检测患者外周血中ddcfDNA的含量，将成为器官移植排斥反应检测的新的研究热点。
发生排斥反应增加了器官移植失败的风险，影响移植器官的正常功能。不同器官移植急性排斥反应的发生率也有所不同，小肠移植急性排斥发生率约55%，心脏移植和肺移植急性排斥发生率分别是45%和30%～40%[1,2,3]。肝、胰腺联合移植以及肾移植术后2年急性排斥反应的发生率分别为20%和12%～14%[4,5,6]。目前临床诊断移植器官发生急性排斥反应的方法包括临床表现检查、血清学检查以及移植器官组织活检等。
肝移植发生急性排斥反应的临床表现包括不明原因的发热、食欲减退、精神欠佳、肝区胀痛和黄疸加深等。肾移植发生急性排斥反应的临床表现包括尿量减少、发热、血压增高、移植肾区肿胀疼痛、体重增加以及肌肉关节疼痛等。肺移植发生急性排斥的临床表现特异性不强，包括低热、气短、咳嗽、低氧、白细胞增多和肺功能下降等。由于临床表现缺乏特异性，对医生的临床经验依赖较大。
cfDNA是指游离于细胞外的部分降解了的机体内源性DNA，主要来自于细胞的凋亡或坏死。细胞的程序性凋亡会引起核小体酶对基因组DNA进行规则性剪切，形成以166 bp为主峰的大小片段分布。通过基因组上携带的SNP(Single nucleotide polymorphisms，SNP)遗传标记，可以把异源或自体突变的游离DNA从本体的游离DNA中区分开。由于异源游离DNA的突变一般是低频的，因此对检测技术提出了更高的要求。
目前，在器官移植上检测cfDNA常用的技术主要有：荧光定量PCR、多重PCR、数字PCR(ddPCR)、目标区域捕获测序和全基因组测序等[14]。Adamek等[15]通过ddPCR技术检测肾移植术后血清中ddcfDNA的含量，在8例肾移植受者的血清中均检测到ddcfDNA，ddcfDNA的含量为0.01%～1.79%。虽然ddPCR灵敏度高，但一次性检测的SNP位点数较少，影响ddcfDNA的准确定量。De等[16]采用全基因组测序(24M reads)对肺移植受者的血浆cfDNA进行检测，对ddcfDNA定量，并对病原菌的cfDNA鉴定来监测感染的发生，结果发现，术后48 h内ddcfDNA含量升高，1周后降到正常水平，且cfDNA可早于气管活检检测到排斥反应的发生。但这篇文章使用的ddcfDNA定量方法较为粗略，不能在位点分型的基础上进行ddcfDNA定量，检测灵敏度低，且全基因组测序的费用相对较贵，难以应用于常规临床检测。Grskovic等[17]通过多重PCR方法对心脏移植受者的266个SNP位点进行检测发现，排斥反应发生时ddcfDNA含量上升5倍。多重PCR可以同时对上百个SNP位点进行检测，但对低频变异检测灵敏度较差，早期排斥反应较难被检测到。临床上需要一种定量准确、灵敏度高、成本和周期都合适的检测方法。利用高通量目标区域捕获测序一次性检测上千个SNP位点，并结合生物信息分析来准确定量ddcfDNA，是未来一个较好的检测方法。
Lo等[18]较早在女性肝、肾移植受者的血浆中检测到来自男性供者的Y染色体的cfDNA，被认为是供者器官凋亡或坏死产生的，因此提出cfDNA可以作为器官移植发生排斥反应的标志物。之后对31例女性肾移植受者研究显示，在她们的尿液中也检测到供者组织凋亡的DNA，ddcfDNA的平均含量为8.7%[19]。
近几年关于cfDNA在器官移植中应用的文献研究，主要从以下两个方面来阐述：ddcfDNA含量阈值与排斥反应的关系以及定量方法的探讨(表1、表2)。不同器官细胞凋亡来源的游离DNA在外周血中的含量是不同的，不同器官移植急性排斥反应发生时ddcfDNA的浓度阈值也不同。目前在肾移植、肝移植、心脏移植和肺移植中对ddcfDNA浓度阈值与排斥反应的关系研究较多。De等用二代测序(Next Generation Sequencing，NGS)的方法对ddcfDNA定量。通过与心内膜活检结果相比，发现ddcfDNA检测可以诊断心脏移植后的急性排斥反应，当ddcfDNA含量阈值为0.25%时，灵敏性为58%，特异性为93%，此时能够区分急性排斥反应与不排斥反应，且曲线下面积(Area Under the Curve，AUC)为0.83[20]。Roy等对ddcfDNA精确的定量，发现ddcfDNA的含量能够区分活检证实的急性排斥(包括抗体介导的排斥和细胞介导的排斥反应)和非急性排斥反应，也可以用来评估移植肾损伤程度，当ddcfDNA含量小于1%表明没有急性排斥反应，大于1%则表明有急性排斥反应(阳性预测值为44%)[21]。Agbor-Enoh等用二代测序技术对心脏移植受者血浆ddcfDNA精确定量，发现急性排斥反应样本的ddcfDNA的含量相比轻度排斥反应样本显著升高(2.73% VS 0.14%；P<0.001)[22]。Ekkehard等用ddPCR技术对肝移植患者血浆ddcfDNA精确定量发现活检证实的急性排斥患者的ddcfDNA的含量(中位数为29.6%，95%CI为23.6%～41.0%)与移植物功能稳定的受者(中位数3.3%，95%CI 2.9%～3.7%；P<0.001)相比显著升高[23]。在肺移植的研究中也发现移植术后48 h内ddcfDNA含量升高，1周后降到稳定的基线水平，且ddcfDNA含量的升高早于气管活检的发现[16]。说明cfDNA的检测不仅实时无创，且准确性优于活检。
ddcfDNA含量阈值与排斥反应
ddcfDNA含量阈值与排斥反应
| 方法 | 移植例数 | 结论 |
|---|---|---|
| 多重PCR＋NGS技术 | 565例心脏移植 | 与心内膜活检结果相比，当ddcfDNA的含量设为0.25%时，灵敏性为58%，特异性为93%，此时能够区分急性细胞排斥反应。且曲线下面积为0.83 |
| 多重PCR＋NGS技术 | 384例肾移植 | ddcfDNA含量小于1%表明没有急性排斥反应，大于1%则表明有急性排斥反应(阳性预测值44%)。ddcfDNA的含量也可以用来评估移植损伤 |
| NGS技术(全基因组) | 127例心脏移植 | 急性排斥反应与轻度排斥反应的样本相比ddcfDNA的含量显著较高(2.73% VS 0.14%; P<0.001) |
| NGS技术(全基因组) | 398例肺移植 | 通过与支气管活检结果相比较，发现ddcfDNA能够区分肺移植后的急性反应与慢性反应(AUC 0.9，灵敏度为1.0，特异性为0.73，ddcfDNA阈值水平为1%) |
ddcfDNA定量方法在器官移植中的应用
ddcfDNA定量方法在器官移植中的应用
| 方法 | 移植例数 | 结论 |
|---|---|---|
| qPCR技术 | 8例肾移植 | 模拟稀释的血浆样本中，在1：16 (6.25%)配比稀释的情况下，该方法也能够很好的检测出。另外在8例肾移植样本中均检测到了ddcfDNA，最低含量为0.48 GE/ml血浆。 |
| 数字PCR技术 | 34例肾移植 | 与Raindrop和QuantStudio 3D检测平台相比QX200的假阳性检测率更低。使用QX200对ddcfDNA定量，发现血浆中检测到的ddcfDNA的含量(平均为1%)相比尿液中检测到的含量较低(平均为55%) |
| 多重PCR＋NGS技术 | 1117例肾移植 | 可以很可靠的测量ddcfDNA的含量(检测空白限0.1%，检测限0.16%，定量限0.2%)，检测范围0.2%～16%。此方法不需要供体基因型也可定量 |
| 数字PCR技术 | 10例肝移植，9例肾移植，8例心脏移植 | 发现移植功能稳定的患者血浆中ddcfDNA的含量分别为肝移植<6.8%，肾移植<2.5%，心脏移植<3.4%。该方法能够经济、快速的量化患者血浆中的ddcfDNA |
Grskovic等发现，NGS技术可以准确的对心脏移植受者的血浆ddcfDNA定量(空白限0.1%，检测限0.16%，定量限0.2%)，检测范围0.2%～16%。此方法适用于单一器官移植的受者且不需要供者、受者基因型[17]。Adamek等用qPCR的方法检测供者来源的ddcfDNA，模拟了受者术后的血浆，在1∶16 (6.25%)配比稀释的情况下，该方法能够较好的检测出"ddcfDNA"。在8例肾移植样本中均检测到了ddcfDNA，最低含量为0.48 GE/ml血浆[24]。Julia等用ddPCR技术对肾移植、肝移植和心脏移植术后受者的血浆ddcfDNA进行定量，发现移植物功能稳定的受者的ddcfDNA的含量分别为肝移植<6.8%，肾移植<2.5%，心脏移植<3.4%。且此方法能够经济、快速的定量ddcfDNA[25]。而后Lee等评估了ddPCR技术检测肾移植排斥反应的灵敏性，该文章比较了3种ddPCR检测平台，发现与Raindrop和QuantStudio 3D检测平台相比QX200的假阳性检测率更低。使用QX200对ddcfDNA定量，发现血浆中检测到的ddcfDNA的含量(平均为1%)相比尿液中检测到的含量较低(平均为55%)。由于一次性检测的SNP位点太少，对ddcfDNA的定量不准确，因此，ddPCR技术对ddcfDNA的定量不足以预测患者的临床状况[26]。
个体间药物代谢差异导致药物浓度的不稳定仍困扰着许多移植患者，个体化用药始终是移植后指导免疫抑制药物治疗的热点话题。由于药物的不良反应和个体差异性，受者需要定期监测血药浓度以保证药物浓度维持在治疗区间内。合理的血药浓度能有效避免移植后免疫排斥反应和药物不良反应的发生。但传统的免疫抑制药物浓度监测有非常严重的局限性。首先是一部分移植受者的免疫抑制药物不能在术后早期及时达到标准浓度范围内，治疗药物监测无法对该部分受者做出准确的判断；其次是治疗药物监测无法稳定预测及区分排斥反应和药物所致的毒性反应[27]。目前，已经提出ddcfDNA的含量可用于检测肝移植患者在临床上的无效免疫抑制，以及预防过度免疫抑制和减少免疫抑制药物最小化期间的不良反应[28]。
Oellerich等提出了ddcfDNA在建立最小最有效的他克莫司浓度的作用，从而创造出个性化的免疫抑制治疗的可能性[29]。随后的研究表明即使存在许多复杂的并发症，ddcfDNA也可用于评估个体对免疫抑制治疗的反应[30]。根据ddcfDNA含量的变化，并结合现有生物标志物的水平变化，适当调整免疫抑制药物的使用量，观查记录患者用药后的临床反应。根据临床反应的变化总结免疫抑制药物的使用量和ddcfDNA含量的相关性，探讨cfDNA检测在指导临床免疫抑制药物使用上的可行性，将是未来进一步研究的方向。
游离DNA是最新的指示移植器官健康状态的生物标志物，具有无创、实时和准确性高等检测优势。检测cfDNA上的SNP位点可以区分供者来源的游离DNA，并对其进行定量评估。而二代测序可一次性检测几千或几万个SNP位点，使定量结果越来越准确。随着基因测序成本的降低，利用二代测序对ddcfDNA的定量将为器官移植排斥反应的检测带来更大优势。
由于目前还缺少统一标准，不同的实验室对ddcfDNA定量方法不同，因此排斥反应的阈值也稍会有区别，但是在同一方法下对患者的连续监测或两个患者之间的比较是可行的。将来还需更多的样本去探究器官移植排斥反应时的ddcfDNA含量阈值。目前基于二代测序对ddcfDNA检测需要人民币2000元以内，具体标准还不统一，美国加州CareDx公司预计2017年10月发布ddcfDNA监测肾移植器官排斥反应产品，售价约为1000美元。目前主要的花费在高通量基因测序，随着基因测序成本的逐渐降低，ddcfDNA的检测费用会逐渐降低。
另外，二代测序对cfDNA的高通量检测，也为器官移植病原菌感染检测提供了强有力的工具。基于cfDNA标志物，通过二代测序同时检测器官移植受者的免疫排斥反应和病原菌感染情况将会为临床研究提供非常好的研究思路。
