探讨大鼠肾缺血再灌注(IR)过程中流体剪切力(FSS)改变引起肾损伤的机制。
1．细胞实验：将人脐静脉内皮细胞株(HUVEC)分为4组，(1)应用平板流体小室系统对HUVEC加载12 dyn/cm2的FSS 30、45、90 min；(2)将HUVEC加载FSS 2 h后停止加力，并分别培养1、3、8、12 h；(3)将0、1、2、4、8 mmol二甲双胍分别对HUVEC预处理培养24 h；(4)对照组为正常培养HUVEC。采用蛋白质印迹法检测各组细胞内p-AMPK/AMPK蛋白表达水平。2.体内实验：取成功建立IR模型的SD大鼠16只，采用随机数字表法分4组，每组4只：(1)低温静态保存(CS)组：将离体大鼠双肾冷保存4 h；(2)低温机械灌注保存(HMP)组：将离体大鼠双肾持续灌注0℃乳酸林格液4 h。(3)二甲双胍处理组(Met-CS组)：术前连续3 d腹腔注射二甲双胍，获取离体大鼠双肾后冷保存4 h；(4)对照组离体大鼠双肾热缺血30 min后不做任何处理。采用原位末端标记法、HE染色等观察各组大鼠肾组织损伤情况，采用免疫组织化学法检测肾组织内p-AMPK蛋白表达和分布规律。分析FSS缺失与肾组织AMPK表达间的相关性。
FSS可上调HUVEC内p-AMPK表达水平，并随作用时间延长表达升高；停力后，HUVEC内p-AMPK蛋白表达随时间延长逐渐降低(P<0.05)；二甲双胍可激活AMPK活性，并随浓度增加而升高(P<0.05)。HMP组肾组织内p-AMPK含量明显高于CS组(P<0.05)，HMP组肾组织内p-AMPK表达主要分布于肾小管处，少数于肾小球内皮细胞和血管处。HMP组肾组织细胞凋亡率明显低于CS组(P<0.05)。HMP组大鼠肾组织损伤轻，无水肿，肾小管轻度扩张；而CS组肾组织损伤严重，肾小管明显水肿。
大鼠肾IR过程中，FSS改变可能通过AMPK途径影响肾组织损伤。
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长期以来，对于肾缺血再灌注(IR)损伤的研究多聚焦在缺氧、能量代谢等方面，而对血流剪切力(FSS)改变与IR损伤之间的相关性研究较少。低温静态保存是临床供肾保存的标准方式，近年来为降低扩大标准供肾在保存阶段所遭受的IR损伤，机械灌注保存方式的应用逐渐增多，其临床获益也提示了FSS的改变在肾脏IR损伤过程中扮演重要角色[1]。正常生理条件下，体内血管内皮处于连续不断的血液层流中，血流所产生的FSS对于维持正常血管内皮细胞功能具有重要意义。研究发现内皮细胞膜蛋白或细胞骨架蛋白可做为机械力感受器，将物理信号转为化学信号，进一步经过各种信号通路影响细胞的代谢变化；并发现FSS可激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)，通过ERK-5信号通路激活下游KLF-2的表达上调，从而发挥对血管内皮的保护功能[2,3]。然而，在肾IR过程中FSS的改变对器官影响的相关基础研究甚少。本研究中，我们基于器官缺血时FSS的彻底缺失，通过细胞和动物实验，探讨血管内皮表面FSS的改变与AMPK表达及肾IR损伤的相关性。
(1)试剂：胎牛血清和1640培养基购自美国GIBCO公司，蛋白提取试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，鼠抗β-actin、山羊抗兔和山羊抗鼠二抗购自北京中山金桥生物技术有限公司，兔抗Phospho-AMPKα(Thr172)和鼠抗AMPKα购自美国CST公司，二甲双胍购自武汉贝尔卡生物医药有限公司。(2)仪器：自制细胞剪切力加载系统，美国Heal Force公司细胞培养箱，日本Olympus公司倒置相差显微镜，德国Eppednorf公司低温高速离心机，美国BioRad公司微型垂直蛋白电泳系统，美国Alpha Innotech公司凝胶图像分析系统。
人脐静脉内皮细胞株(HUVEC)购自美国模式培养物集存库(ATCC)，按细胞说明书操作传代培养。用2.5 g/L的胰蛋白酶消化后，按照1∶3的比例进行传代，将培养瓶置于37 ℃含体积分数5%CO2及饱和湿度的培养箱中进行培养。每2～3 d更换培养液，待细胞生长融合至80%～90%时，用胰蛋白酶消化继续传代培养。
将融合至80%的HUVEC经胰酶消化后，制成细胞悬液，加入细胞计数板上进行细胞计数。将细胞悬液密度调整为1×105个/ml，再将细胞悬液滴在盖玻片上，滴加含血清的1640完全培养基，置于37 ℃含体积分数5%CO2及饱和湿度的细胞培养箱。待盖玻片上细胞融合至90%后移去完全培养基，换成无血清培养基继续培养2～8 h，防止培养基中成分对实验结果造成影响。
挑选融合80%的细胞盖玻片，随机分为4组：(1)加载流体剪切力组(FSS组)：加载12 dyn/cm2流体剪切力30、45、90 min；(2)加载流体剪切力后停力组(FSS-Stop组)：加载12 dyn/cm2流体剪切力适应2 h后停力培养1、3、8、12 h；(3)对照组：不予任何处理；(4)二甲双胍组：加不同浓度(1、2、4、8 mmol)二甲双胍培养24 h。将剪切力系统消毒后置入恒温箱中，连接好装置，加入预热(37℃)的无血清1640培养基50 ml作为循环液。将细胞爬片置于流体小室的凹槽中，细胞面朝上。加载流体剪切力时缓慢调节蠕动泵转速，直至强度达到12 dyn/cm2[4]。
采用蛋白质印迹法进行检测。取出各组盖玻片，按试剂盒说明提取细胞蛋白，用BCA法测量蛋白浓度，计算并制备样品。聚丙烯酰胺凝胶电泳后转移至PVDF膜，含5%BSA的TBST进行封闭，分别加入兔抗p-AMPKα(Thr172)和鼠抗AMPKα抗体(均为1∶1 000稀释)，于4 ℃下孵育过夜。洗膜后加辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔和山羊抗鼠二抗于室温下孵育2 h。ECL显色液1∶1混匀滴加在PVDF膜上显像曝光。以上实验均重复3次，用Image J软件分析各水平蛋白表达的累积吸光度值(A值)。
选用无固定病原体级(SPF级)成年雄性SD大鼠16只，体重为220～240 g，由甘肃中医学院医学实验中心提供。
手术器械包括显微外科手术器械、冷光手术灯、医用无损伤缝合线、医用纱布及棉球等。试剂包括戊巴比妥钠、盐酸二甲双胍、乳酸林格液、生理盐水等。
取大鼠，腹腔注射戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉，并皮下注射肝素钠1 000 U/kg抗凝。常规腹部备皮及消毒，行腹部正中切口开腹，游离上下段腹主动脉和下腔静脉，充分暴露双肾。夹闭上下段腹主动脉及下腔静脉，将腹主动脉上段剪口行腹主动脉插管，热缺血30 min后经腹主动脉以40 cmH2O压力缓慢注入0 ℃的乳酸林格液原位灌注双肾，同时，剪断下腔静脉引流。待双侧肾脏变白后分别离断上下段腹主动脉和下腔静脉，离断肾脏临近组织，进行后续操作。
取成功完成IR模型大鼠16只，采用随机数字表法分为4组，每组4只。(1)低温静态保存组(CS组)：将离体大鼠双肾置于自制的0 ℃冰盒中冷保存4 h。(2)低温机械灌注保存组(HMP组)：将离体大鼠双肾持续灌注0 ℃的乳酸林格液4 h。(3)二甲双胍处理组(Met-CS组)：术前连续3 d腹腔注射二甲双胍生理盐水300 mg·kg－1·d－1，获取离体大鼠双肾后置于自制的0 ℃冰盒中冷保存4 h。(4)对照组：大鼠双肾热缺血30 min后，灌注0 ℃乳酸林格液，待双侧肾脏变白，获取肾脏浸入100 g/L甲醛溶液固定。
按照Tunel凋亡检测试剂盒(Roche，货号：11684817910)说明书操作。取各组大鼠肾脏，石蜡切片，脱蜡至水，加入蛋白酶K 20 μg/ml，于37 ℃下孵育20 min，按1：9混合加入适量TdT和dUTP反应液，于37 ℃下孵育2 h，二氨基联苯胺(DAB)显色5 min，苏木素复染细胞核，脱水、透明、封片。阴性对照Tunel反应液中不加TdT。每组切片随机挑选肾皮质区域至少3个200倍视野进行拍照，凋亡细胞核固缩呈棕褐色。应用Image-Pro Plus 6.0软件选取肾皮质区域相同的棕黄色细胞核作为判断所有照片阳性细胞的统一标准，选取相同的蓝色细胞核为总细胞，计数并求出肾皮质内阳性细胞百分比(阳性细胞数/总细胞数×100%)即为凋亡率。
将各组大鼠肾脏用40 g/L甲醛固定24 h，石蜡包埋后行肾组织切片(厚5 μm)，所得切片进行标准HE染色，显微镜成像系统下观察肾组织病理损伤情况。
采用免疫组织化学法。将各组肾组织石蜡包埋，切片，按照生物素-酶标链亲和素(SP)法免疫组织化学试剂盒操作。加入兔抗p-AMPKα(1∶200稀释)，于37 ℃下孵育2 h；二抗为生物素标记的山羊抗兔IgG, DAB显色5 min。通过采图系统Image-Pro Plus6.0采集分析图像，每张切片随机选取5个不同的低倍镜视野，细胞内呈黄褐色者判定为p-AMPK阳性表达细胞，每个视野计数阳性表达细胞，取其均值作为增殖指数。
所有实验至少重复3次，采用SPSS(19.0版)软件进行统计处理，实验数据以均数±标准差(
±s)形式表示，组间均数的比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
蛋白质印迹定量分析结果显示，FSS组HUVEC经FSS作用30 min时，p-AMPK表达较对照组显著升高(P<0.01)，且随FSS作用时间的延长呈现增长趋势，但FSS组内p-AMPK蛋白表达的比较，差异均无统计学意义(P>0.05，图1)。
蛋白质印迹定量分析结果显示，停力后，FSS-Stop组HUVEC内p-AMPK蛋白表达水平随停力时间的延长而逐渐降低；FSS-Stop组停力后1、3、8 h时的p-AMPK表达水平均显著高于对照组(P<0.01或<0.05)；停力3 h至8 h时下降最明显(P<0.05)；停力8 h后降低趋势不显著(P>0.05)；停力12 h时与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05，图2)。
蛋白质印迹定量分析结果显示，随着二甲双胍浓度的增加，HUVEC内p-AMPK表达水平逐渐升高，各浓度间p-AMPK表达的差异均有统计学意义(P<0.05)；与对照组比较，经1 mmol的二甲双胍作用24 h时，HUVEC内p-AMPK蛋白表达水平升高并不明显(P>0.05)；当二甲双胍浓度达到2 mmol及以上时，p-AMPK的表达均较对照组显著升高(P<0.01或<0.05)。
经保存(灌注保存或冷保存)后，各组p-AMPK的表达多分布于肾小管，有少数分布于血管极和动脉血管处(图4)。CS组肾组织内p-AMPK表达量均显著低于对照组、HMP组和Met-CS组(P<0.05)；对照组、HMP组、Met-CS组三组间差异均无统计学意义(P>0.05，图5)。
HMP组和Met-CS组细胞凋亡率分别为(3.19±1.80)%和(8.09± 0.76)%，均显著低于CS组的(19.52±2.96)%(P<0.05)；CS组和Met-CS组细胞凋亡率均显著高于对照组的(1.85±0.70)%(P<0.01)；HMP组与对照组和Met-CS组相比，差异均无统计学意义(P>0.05，图6)。
对照组肾小球、肾小管未见异常；HMP组肾小球饱满无明显变化，肾小管管腔轻度扩张；CS组肾小球毛细血管管腔狭窄、体积轻中度缩小，肾小管上皮细胞明显水肿、变性、刷状缘结构不清；Met-CS组肾小球体积略小，肾小管上皮细胞轻度水肿(图7)。
器官移植后组织功能的恢复与器官的获取和保存密切相关[5]。低温静态保存一直是临床供肾保存的标准方式，一些研究发现持续低温保存的缺血过程可引起一系列分子改变，影响内皮细胞功能和再灌注后器官功能恢复[6,7]。近年来为降低扩大标准供肾在保存阶段造成的IR损伤，机械灌注保存方式的应用逐渐增多[8]。经机械灌注保存的扩大标准供肾在术后短期移植肾功能明显优于低温静态保存方式，而其具体保护机制仍然不明，可能存在的因素包括机械灌注可以不断提供营养、带走代谢废物、模拟生理条件下血管内皮经受FSS的内环境。机械灌注保存方式的应用，实现了器官在缺血时仍保证血管内皮细胞处于一定FSS中，我们推测FSS的存在可能是其潜在的保护机制。
FSS即血液流动时平行作用于血管内皮的摩擦力，并受管径、流体粘稠度和流体模式的影响，可精细调节多种效应分子的反应及激活血管内皮细胞某些基因表达。血管内皮细胞可受到FSS的直接作用，感受机械信号的刺激，并将机械信号转化为化学信号，发挥调节信号通路转导、基因的表达及蛋白活化等作用，FSS与血管内皮之间的相互作用的研究主要集中在心血管疾病方面，如高血压、动脉粥样硬化等[9]。AMPK是一种存在于真核细胞中高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是生物能量代谢调节的关键分子，能被机械应力、剧烈运动、激素和能影响细胞代谢物质等激活。Young等[10]研究发现，FSS作用于HUVEC可经ERK5/MEF2信号通路激活AMPK，上调抗炎转录因子KLF-2，进而减轻内皮细胞炎症反应及动脉粥样硬化效应。胡晓燕等[11]研究发现，持续低温灌注可通过上调KLF-2因子、抑制NF-κB的表达，减轻大鼠肝脏IR的炎症反应。
本研究中细胞实验结果显示，FSS可激活HUVEC内p-AMPK蛋白的表达，且随FSS作用时间的延长呈现增长趋势。FSS任何形式的长时间改变都将引起血管内皮细胞功能紊乱，如FSS增高、降低及非层流式FSS等。一系列研究表明，在移植肺保存中，肺组织虽处于缺血状态，但在呼吸机辅助下并未发生组织缺氧，而再灌注后，肺组织仍发生了氧化应激损伤，其中FSS缺失与突现便参与其中。在FSS缺失后短时间内，肺毛细血管内皮细胞的机械力感受器可将物理信号转化为化学信号，通过细胞膜去极化而激活PI3K/Akt信号通路后，激活NADPH氧化酶2(NOX2)，产生活性氧类(ROS)，后者可激活多种转录因子，如HIF-1a，NF-κB和AP-1等。上述信号通路的短期激活可能有益于内皮细胞对于FSS缺失的适应，而长时间后大量的ROS可诱发内皮细胞炎症反应或细胞凋亡[12,13]。
器官缺血时，FSS是彻底缺失的，而非存在形式的改变。我们推断FSS的缺失同样会引起内皮细胞功能损伤。本研究中细胞实验结果显示，FSS的缺失会降低HUVEC内p-AMPK的表达，并随时间延长逐渐降低，FSS缺失12 h后，HUVEC内p-AMPK水平降至近似于对照组水平。
Gracia-Sancho等[14]研究发现，流体的缺失会导致保护型内皮血管因子的缺失，引起急性内皮细胞功能障碍及细胞凋亡。本研究动物实验中，通过离体肾脏灌注持续提供生理性FSS，HMP组肾组织p-AMPK的表达水平较CS组显著升高，细胞凋亡率较CS组显著降低，并且HMP组肾小球、肾小管及上皮细胞形态基本正常，而CS组肾小管上皮细胞明显水肿、肾小球毛细血管管腔狭窄及体积缩小。持续灌注所提供的FSS可激活肾组织内AMPK活性，从而减轻肾缺血过程中的损伤。另外，观察到AMPK的激活多定位在肾小管处，也可在血管极及少数动脉血管处表达，我们猜测可能是由于肾小管上皮细胞对各种刺激较敏感，而对于肾小球及其动脉血管低表达p-AMPK也将成为我们下一步研究目标。
Seo-Mayer等[15]研究发现，给予二甲双胍后小鼠肾脏中也具有大量活性AMPK，进而减轻肾IR所致的肾小管损伤。AMPK级联反应的激活具有潜在的维持上皮细胞极性的能力，AMPK激活后肾小管上皮细胞中的Na＋-K＋-ATP酶由细胞膜向胞质中异位，用二甲双胍预激活AMPK可能在肾脏缺血损伤前就减少了钠的主动转运这一主要耗能过程，相应地减少了肾组织在缺血时代谢易受损状态下的能量需求，从而在一定程度上耐受缺血，并减轻损伤。本研究结果表明，HUVEC经二甲双胍预处理24 h后，可显著上调细胞内p-AMPK表达水平，且随二甲双胍浓度的增加而升高；Met-CS组肾组织内p-AMPK表达水平明显高于CS组(P<0.05)，与HMP组和对照组相比差异均无统计学意义(P>0.05)。Met-CS组肾组织的细胞凋亡率明显低于CS组(P<0.05)。Met-CS组肾小管上皮细胞水肿较轻。因此，二甲双胍同样可激活大鼠肾脏组织内AMPK活性，进而减轻低温静态保存过程的肾脏损伤。
本研究中，动物实验结果与我们预计并不完全相符，AMPK并未在肾小球及动脉血管处大量激活，而广泛在肾小管处被激活，我们课题组也将进一步研究FSS与肾小管之间的关系。本研究中我们以缺血过程中FSS缺失为出发点，通过细胞和动物实验，发现AMPK活性随FSS缺失而降低，这也可能是持续灌注保存方式的潜在保护机制，其具体机制仍需进一步研究。
