观察脑死亡后心脏形态学和相关炎症因子的变化特点，探讨脑死亡致心脏损伤的机制，为临床利用脑死亡供者进行心脏移植提供实验依据。
采用随机数字表法将30只家兔平均分为两组，即假手术组和脑死亡组，脑死亡组建立家兔脑死亡模型，假手术组不进行颅内缓慢加压，其他处理两组均相同。两组均在术后2、6、8 h记录家兔动脉血压、心率和呼吸变化；HE染色观察心脏组织病理损伤情况；采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测血浆中白细胞介素1β(IL-1β)、IL-6和IL-8水平；采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫组织化学法检测心脏组织中各炎症相关因子的表达。
在家兔脑死亡模型建立成功后8 h内，脑死亡组和假手术组家兔动脉血压、心率的差异均无明显统计学意义(P>0.05)；病理检查结果显示，脑死亡组心尖组织的病理损伤程度较假手术组明显加重。随着脑死亡时间的延长，脑死亡组家兔血清中IL-6、IL-8的浓度较假手术组显著升高(P<0.05)，但在脑死亡后2 h内两组间IL-1β水平的差异并无统计学意义(P>0.05)。此外，脑死亡组心尖组织中热休克蛋白27(HSP27)、HSP70 mRNA表达水平以及ICAM、NF-κB蛋白表达量较假手术组明显增高(P<0.05)。
随着脑死亡时间延长，心脏组织中炎症因子和血清中白细胞介素含量均增高，表明脑死亡状态使供者心脏发生了炎症反应，从而影响供心质量。
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心脏移植是对终末期心脏病最有效的治疗方法之一[1]。近年来，心脏移植的手术成功率逐年提高，但术后早期并发症仍然非常严重，尤其是出现早期原发性移植物功能衰竭，以致严重影响移植受者的预后，甚至导致受者死亡[2]。有报道显示，脑死亡供者器官是影响心脏移植成功率的一个重要因素[3]。脑死亡所产生的一系列机体改变，均可对受者器官的质量和免疫活性产生影响，进而影响移植术后移植物的存活率及受者的预后状况。目前认为，脑死亡对心脏功能的影响主要与血流动力学改变、中枢神经系统损害、严重的心肌损害、神经体液系统的改变、代谢失衡和细胞因子的激活有着密切的关系。本实验通过建立渐进性加压兔脑死亡模型，探讨脑死亡状态下不同时间点心脏形态学和相关炎症因子变化规律，从而研究脑死亡对心脏损伤的作用机制，为临床合理进行心脏移植提供理论依据。
健康雄性新西兰白兔30只，无固定病原体级(SPF级)，兔龄12周，体重(2.9±0.3)kg，购自武汉万千佳禾实验动物养殖中心，实验动物许可证号：SCXK(鄂)2007-0006。所有动物均给予自由标准饮食，饲养于标准实验条件(温度20～25 ℃，湿度50%～70%)。
BL-420生物机能实验系统、HX-100E动物呼吸机、JR-1/2智能恒温控制仪均为成都泰盟科技有限公司产品；多功能心电监护仪为美国惠普公司产品；Fogarty 3F球囊导管为美国Baxter公司产品；PE50导管购自上海瑾瑜商贸有限公司；颅骨钻购自上海医疗器械集团。白细胞介素1β(IL-1β)、IL-6及IL-8酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自美国R&D公司，抗热休克蛋白70(HSP70)、抗细胞间粘附分子(ICAM)及抗核因子κB(NF-κB)单克隆抗体均购自美国Abcam公司，辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠单克隆抗体(SC-2005)购自美国Santa Cruz公司，RevertAid™反转录试剂盒购自美国Fermentas公司，盐酸多巴胺注射液(规格20 mg/2 ml)购自上海禾丰制药有限公司(批号：1005045)。
实验动物术前禁食12 h，自由饮水。参照Pratschke等[4]的脑死亡模型制作方法并加以改进，采用缓慢颅内加压法。实验动物称重，按500 mg/kg沿家兔耳缘静脉注射戊巴比妥进行全身麻醉。腹股沟部剪毛备皮，沿腹股沟区股动脉搏动处作一长约4～5 cm的纵行切口，止血钳分离肌肉及深筋膜，暴露左侧股动脉和股静脉。分别行气管插管，股动脉连接压力换能器，股静脉连接微量注射泵。同时，对家兔进行气管切开术，连接呼吸机，进行机械通气支持并检测呼吸波。随后，用颅骨钻沿颅骨矢状线开颅，于硬膜外隙置入Foley 18F气囊导管，向气囊中缓慢注水加压，密切观察家兔脑电图、血压及心率的变化约10 min，待生命体征平稳后，再继续注水加压，其间保持平均动脉压变化维持在正常范围内(15.96 kPa以上)，必要时用股静脉滴注盐酸多巴胺升压，如此循环，直至脑电图为一直线时停止加压。观察家兔瞳孔对光反射、角膜反射及自主呼吸均已消失后，即成功建立脑死亡模型。
采用随机数字表法将30只家兔平均分为两组。(1)假手术组：行股动静脉插管、气管插管和颅骨钻孔置管术，但不进行颅内加压脑死亡术；(2)脑死亡组：行股动静脉插管、气管插管、颅骨钻孔置管术及颅内加压脑死亡术。采用生物机能实验系统、小动物呼吸机和多功能心电监护仪监测脑死亡前、脑死亡时和脑死亡后2、6、8 h两组家兔的平均动脉血压(MAP)、心率和呼吸频率，保证脑死亡模型的稳定。两组兔均在脑死亡后2、6和8 h收集血清，并通过撤离呼吸机导致各5只家兔心死亡从而采集心尖组织。
在脑死亡2、6、8 h时，收集两组家兔的血清，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定血清中IL-1β、IL-6、IL-8的水平；每个时间点每组各取5只家兔，处死后摘取其心尖组织，并剪成1 cm×1 cm×1 cm的小组织块，将部分心尖组织置于冻存管中，储存于－80 ℃冰箱，备检；另一部分进行病理检查和免疫组织化学检查。
取家兔心尖心肌组织块，置入体积分数10%的甲醛溶液中，使组织、细胞的蛋白质凝固变性，使其保有细胞原本的形态。石蜡包埋，切片机切片(厚5～8 μm)并贴片，二甲苯脱蜡。依次用苏木精和伊红对切片进行染色，各5 min。无水乙醇脱水，二甲苯使切片透明，加拿大树胶封固后，在100倍光镜下观察脑死亡家兔心肌组织的病理损伤情况。
采用逆转录-聚合酶链锁反应(RT-PCR)法进行检测。取冻存的心脏组织，在液氮下研磨成粉末状，并用Trizol试剂提取mRNA，用RevertAid™逆转录试剂盒获得cDNA，并行PCR扩增。引物序列分别为：HSP27的上游引物：5’-GCGTGTCCCTGGATGTCAAC-3’，下游引物：5’-TGTATTTCCGCGTGAAGCAC-3’；HSP70上游引物：5’-ATGACGCGCGACAACAAC-3’，下游引物：5’-CCTTGCCCGTGCTCTTGT-3’。GAPDH上游引物：5’-TCTGGCAAAGTGGATGTTGTC-3’，下游引物：5’-TCACGCCCATCACAAACAT-3’。PCR产物用20 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，并进行灰度值分析。HSP27/HSP70 mRNA的相对表达量＝HSP27/HSP70 mRNA灰度值/同一标本GADPH灰度值，并对比值进行统计学分析。
采用免疫组织化学法进行检测。石蜡切片于60 ℃恒温箱中烘烤20 min，二甲苯脱蜡，在100%、97%、75%乙醇中依次浸泡5 min进行水化后，进行抗原热修复，滴加正常山羊血清封闭液，于室温下静置20 min，滴加HSP70、ICAM、NF-κB一抗，于4 ℃下过夜，用磷酸盐缓冲液(PBS)反复洗3次，滴加辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠二抗，于37 ℃下孵育1 h，用PBS洗3次，二氨基联苯胺(DAB)显色5～10 min(显微镜下掌握染色程度)，用PBS冲洗10 min，苏木精复染2 min，盐酸酒精分化，自来水冲洗10～15 min后脱水、透明、封片、镜检。每张切片于400倍显微镜下随机选择不同视野拍照3次。
采用SPSS(18.0版)统计软件对数据进行处理。计量资料以均数±标准差(
±s)表示，组内分析采用ANOVA多因素方差分析，α＝0.05，P<0.05为差异有统计学意义。
建立模型前，脑死亡组和假手术组家兔MAP的差异无统计学意义(P>0.05)。颅内加压过程中，脑死亡组MAP较假手术组明显迅速上升(P<0.01)，并达到峰值，维持一段时间平台期后，MAP缓慢下降到正常值以下，用多巴胺静滴维持血压在110 mmHg以上。脑死亡模型建立成功后，发现在脑死亡2、6、8 h时，脑死亡组和假手术组MAP的差异无统计学意义(P>0.05，图1A)。同样，在脑死亡后，两组家兔在各时间点心率的差异也均无统计学意义(P>0.05，图1B)。颅内加压过程中，家兔的呼吸频率较加压之前明显上升(P<0.05，图1C)，但与假手术组同一时间点呼吸频率的差异均无统计学意义(P>0.05，图1C)。家兔呼吸停止后，用呼吸机予以辅助呼吸。由此可见，脑死亡状态下家兔的血压、心率及呼吸频率均可以维持恒定，与假手术组家兔比较，差异并不明显。
光镜下观察两组家兔心脏心肌组织的病理改变，假手术组心肌细胞成长梭形，排列整齐，染色均匀，细胞核完整，位于细胞中央。脑死亡组家兔脑死亡2 h时，心肌组织基本正常，有少许炎症细胞浸润。脑死亡6 h时，心肌细胞间质水肿，炎症细胞浸润明显增加，心肌细胞增粗变长，有较多分支，心肌细胞核肥大，核深染。脑死亡8 h时，心肌细胞变性坏死，炎症细胞浸润程度加深，将心肌分割成条索状，部分心肌断裂，伴有心肌间质纤维化(图2)。
与假手术组相比，脑死亡组家兔血清IL-6和IL-8在各时间点水平均显著升高，差异均具有统计学意义(P<0.05)；血清IL-1β水平在脑死亡6、8 h时显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。脑死亡组家兔在脑死亡后各个时间点的血清IL-1β、6、8浓度都较上一时间点的水平显著升高，且差异均具有统计学意义(P<0.05)，且IL-6和IL-8的水平升高更加显著(图3)。
假手术组HSP27 mRNA表达量非常低。随着脑死亡时间的延长，脑死亡组心脏组织中HSP27表达量逐渐增加，并在脑死亡8 h时表达量达到最高。同样，HSP70 mRNA的表达量在脑死亡后2、6、8 h逐渐增加，且6和8 h明显高于对应时间点的假手术组的表达(图4，P<0.05)。
免疫组织化学结果显示，ICAM和NF-κB在心肌细胞的胞质中被染成黄褐色颗粒。随着脑死亡时间的延长，脑死亡组ICAM和NF-κB表达逐渐增高，脑死亡8 h时，二者蛋白染色阳性强度达到顶峰。各时间点与相应假手术组相比，脑死亡组ICAM和NF-κB在心肌细胞中的表达量均明显增加，差异均有统计学意义(P<0.05，图5、图6)。
脑死亡状态是指大脑整体功能完全丧失的不可逆性病理状态[5]。如今，脑死亡供者占器官移植的比例逐年增长，尤其对于心脏移植，其供者大部分由脑死亡供者组成[6]。本实验通过建立家兔脑死亡模型，探讨脑死亡状态对心脏损伤的机制，以指导临床上对脑死亡心脏供者的合理应用。
在脑死亡8 h内，如果维持血压稳定，且用呼吸机辅助呼吸，对家兔心脏的生理功能和血液动力学没有明显影响。随着脑死亡时间的延长，心尖心肌组织HE染色可见炎症细胞浸润越来越多，脑死亡8 h时已经充满视野。由此我们推断，心脏组织的间质水肿以及心肌细胞变性、坏死等组织损伤很可能是由炎症因子介导的炎症细胞浸润引起。
根据以上推断，我们检测了家兔血清中白细胞介素的含量。结果发现，其血清浓度随脑死亡时间延长而持续上升，且上升趋势与心尖组织的炎症细胞浸润程度和组织损伤程度存在正相关。同时我们发现，典型炎症相关因子HSP27、HSP70的mRNA的表达量逐渐增加，且ICAM和NF-κB炎症相关蛋白的表达也明显增加。这些炎症因子的表达量增加与血浆中白细胞介素的增加以及心肌组织形态学的变化呈现相同的变化趋势，提示脑死亡后心脏质量好坏与机体炎症程度存在相关性。
有报道表明[7,8]，HSP27和HSP70可激活NF-κB传导通路，进而激活后者下游基因IL-1β、IL-6、IL-8的炎症反应[9]。同时，血清中IL-1β、IL-6、IL-8含量的增加与ICAM表达量的增加有着密切关系，并协同促进机体炎症反应的发生[10,11,12]。因此，本实验研究的4个炎症相关因子和白细胞介素之间相互关联，互为上下游基因，共同对炎症反应的发生产生影响。在脑死亡状态下，这些炎症相关因子和白细胞介素均显著升高，诱导产生炎症反应，从而导致脑死亡供者的心脏损伤。
此外，我们推测，由于心脏表面表达的粘附因子、炎症相关转录因子以及热休克蛋白的含量以及一些炎症介质的合成明显增加，将导致心脏更容易被受者免疫系统所识别，可能增加移植术后免疫排斥反应的发生风险。
综上，脑死亡状态一方面使心脏产生炎症反应，导致心脏的损伤，另一方面增加受者出现排斥反应的风险。然而通过实验我们可以看到，在脑死亡2 h内，心脏的各炎症因子和血清中白细胞介素上升程度并不大，心脏组织的损伤程度也不严重。由此，我们认为，脑死亡后尽早获取供心进行心脏移植，尤其是在脑死亡2 h内，有利于降低心脏的炎症损伤程度，并能更好的不被受者免疫系统所识别，从而提高心脏移植的成功率和术后存活率。
