探讨M2型巨噬细胞在移植肾间质纤维化中的作用。
选取诊断为慢性移植肾肾损伤的肾活检标本30例，同时选取肿瘤旁正常肾组织10例做对照；用Masson染色法评估肾活检组织的间质纤维化程度；用免疫组织化学双染法和图像分析软件检测肾活检组织中CD163(标记M2型巨噬细胞)和SMA蛋白的表达情况，同时收集尿液标本，用双抗体夹心酶联免疫法即ELISA法定量检测尿液可溶性CDl63(sCD163)水平；分析受者血肌酐(Cr)和尿素氮(BUN)与移植肾间质纤维化程度的关系。
移植肾组织中的CD163和SMA显著高于正常肾组织(P<0.05)；随着移植肾间质纤维化程度的加重，肾组织中CD163和SMA的表达逐渐增多，受者血肌酐和尿素氮水平也逐渐升高，并且两者呈正相关(P<0.05)；移植肾组织中CD163的表达与受者血肌酐水平呈正相关(r＝0.937, P＝0.000)；移植肾组织中CD163的表达与尿液中sCD163水平呈正相关。
M2型巨噬细胞在慢性移植肾肾损伤组织中异常高表达，并且与移植肾间质纤维化程度和受者肾功能不全相关。
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肾移植是肾功能衰竭患者的有效治疗手段。目前，移植肾的1年存活率已经普遍超过90%，但移植肾的长期存活状况并没有明显改善[1]。慢性移植肾肾损伤(chranic renal allograft injury，CAI)是肾移植后常见的并发症，主要表现为移植肾功能进行性减退，最终肾功能衰竭。CAI的组织学特征为非特定因素所致的间质纤维化和肾小管萎缩(interstitial fibrosis and tubular atrophy not otherwise specified，IF/TA-NOS)。预防CAI是提高移植肾存活率的主要目标之一。然而，CAI的发生原因和机制尚不清楚。肾移植的一个重要问题是缺乏能够预测CAI进展的生物标志物。因此，我们用免疫组化双染方法检测移植肾组织中CD163和平滑肌肌动蛋白(SMA)的表达情况，同时用双抗体夹心酶联免疫法即ELISA法定量检测受者尿液sCD163水平，进一步分析CD163标记的M2型巨噬细胞及尿液sCD163水平与移植肾间质纤维化和受者肾功能的关系。
选取郑州人民医院病理科2014年至2017年病理诊断为慢性移植肾肾损伤的肾组织石蜡包埋样本30例，其中男性18例，女性12例，年龄18～53岁。用Masson三色染色评估间质纤维化来选取样本，在400倍镜下，每张切片随机选取10个视野，阳性染色面积占整个区域的比值即为纤维化的程度。按Banff 2017移植肾活检诊断标准慢性移植肾肾损伤间质纤维化分3级：Ⅰ级12例，Ⅱ级10例，Ⅲ级8例。同时选取10例肿瘤旁正常肾组织作为对照组，用于对比观察正常肾组织与移植肾组织中CD163和SMA的表达情况，在选取标本时已除外其它已知原因引起的间质纤维化和肾小管萎缩，只选取非特定致病因素引起的间质纤维化和肾小管萎缩，不伴有肾小管炎和动脉内膜炎；在做肾穿刺的当天留取晨尿10 ml，置于尿管中，以2 000/min离心(离心半径10 cm)10 min，然后吸取上层尿液分装于1.5 ml离心管中并作好标记，置于－80 ℃冰箱中保存备用。
浓缩型兔抗人多克隆抗体CD163购自武汉博士德生物工程有限公司，即用型鼠抗人单克隆抗体SMA及DouMaxVision™免疫组化双染试剂盒均购自福州迈新公司，人sCD163 ELISA试剂盒购自美国RD公司。
所有组织标本均经100 g/L甲醛溶液固定，石蜡包埋，2 μm厚连续切片，然后用免疫组织化学Dou Max Vision双染法染色。免疫组化双染操作步骤严格按照试剂盒说明书进行：石蜡切片脱蜡、水化，自来水冲洗；枸橼酸盐缓冲液(0.01 mol/L，pH6.0)高温高压修复；过氧化物酶阻断；滴加正常非免疫动物血清；除去血清，滴加一抗SMA，放置于冰箱内4 ℃过夜；滴加碱性磷酸酶标抗鼠IgG聚合物试剂；滴加BCIP/NBT显色剂(显蓝黑色)，显色10 min，蒸馏水冲洗终止显色；滴加双染增强试剂；滴加一抗CD163，室温下孵育60 min；滴加过氧化物酶标抗兔IgG聚合物试剂；滴加AEC显色剂(显红色)，37 ℃下显色30 min；自来水冲洗终止显色，苏木素复染20 s，PBS返蓝，水性封固剂封固，用中性树胶再次封固。以PBS代替一抗作阴性对照，已知阳性切片作阳性对照。ELISA实验操作按试剂盒说明书进行。
所有结果由有经验的肾移植病理医师判定。
CD163标记M2型巨噬细胞，胞浆红色判读为阳性，在400倍镜下，每张切片至少连续计数9个高倍视野。SMA标记活化的肌成纤维细胞，胞浆蓝黑色为阳性，SMA阳性区域代表间质纤维化的程度。阳性区域计算方法：在200倍镜下，每张切片至少计数6个中倍视野的肾皮质区，避开肾小球和大血管。将所选视野用蔡司显微镜进行拍照，再将图片输入Image pro plus图像处理软件对图片进行分析，记录数值。
用全自动酶标仪在450 nm波长读板，获取吸光度值(A值)，每个标准品和标本的A值应减去空白孔的A值后即为最后A值，然后以标准品浓度为横坐标，吸光值为纵坐标画出标准曲线，并根据A值计算出样品sCD163浓度。然后样品复孔取平均值。
应用SPSS18.0软件进行统计分析。均数用均数±标准差(
±s)表示，组间比较用方差分析，相关性分析采用Spearman等级相关性分析。检验水准α＝0.05，P≤0.05为差异具有统计学意义。
CD163和SMA在移植肾组织中的表达显著高于在正常肾组织中的表达(表1，图1，图2，图3)。
各级纤维化的移植肾组织中SMA和CD163的相对表达量(
±s)
各级纤维化的移植肾组织中SMA和CD163的相对表达量(±s)
| 纤维化程度 | 例数 | SMA | CD163 |
|---|---|---|---|
| 正常 | 10 | 2.9±1.19 | 2.70±2.05 |
| Ⅰ级 | 12 | 21±2.69 | 91.50±25.36 |
| Ⅱ级 | 10 | 39±4.69 | 263.10±51.25 |
| Ⅲ级 | 8 | 63.75±9.22 | 394.75±124.61 |
CD163标记的M2型巨噬细胞在移植肾组织间质中的数量显著高于正常肾组织，并且随移植肾间质纤维化程度的加重，M2型巨噬细胞的数量也增多，差异具有统计学意义(P<0.05)。
SMA在移植肾组织间质中的阳性区域面积显著高于正常肾组织，并且随移植肾间质纤维化级别的升高而增大，差异具有统计学意义(P<0.05)。
受者尿sCD163和血Cr及BUN水平与移植肾组织间质纤维化程度的关系(表2)
受者尿sCD163和血肌酐及尿素氮与移植肾纤维化程度的关系(
±s)
受者尿sCD163和血肌酐及尿素氮与移植肾纤维化程度的关系(±s)
| 纤维化程度 | 例数 | sCD163(ng/mL) | 血肌酐(μmol/L) | 尿素氮(mmol/L) |
|---|---|---|---|---|
| 正常 | 10 | 0.36±0.05 | 65.8±3.99 | 4.87±0.84 |
| Ⅰ级 | 12 | 1.53±0.27 | 172.75±24.55 | 16.78±2.19 |
| Ⅱ级 | 10 | 3.66±0.85 | 266.20±27.99 | 28.10±3.07 |
| Ⅲ级 | 8 | 5.71±1.02 | 447.88±48.52 | 42.88±4.52 |
随着移植肾间质纤维化程度的增加，尿sCD163表达水平逐渐增加，受者的血Cr和BUN平均值也逐渐升高，差异具有统计学意义(P<0.01)。
随着免疫抑制剂的合理应用和手术水平的提高，肾移植已成为挽救肾功能衰竭患者生命的的重要手段。目前，肾移植近期效果已得到显著的改善，但远期效果仍有待提高。慢性移植肾肾病(CAN)是影响肾移植受者远期效果的主要因素，CAN在组织学上主要表现为间质纤维化和肾小管萎缩，然而这些组织学表现不具有特异性，在多种移植肾肾病中均可见到，比如免疫抑制剂的药物毒性、慢性排斥反应、病毒感染等等。Banff 2005摒弃了CAN一词，代之以更准确的术语"间质纤维化和肾小管萎缩，非特定因素所致"，命名为慢性移植肾肾损伤(CAI)[3]。2017年的Banff分类重新定义了慢性活动性T细胞介导的排斥反应，强调间质纤维化和肾小管萎缩区的炎症(i-IFTA)的重要性，中度的i-IFTA伴中或重度的小管炎即可诊断为慢性活动性T细胞介导的排斥反应。工作组认为i-IFTA与移植物的存活率降低有关[4]。本研究在选取标本时已将已知原因引起的间质纤维化和肾小管萎缩排除在外，并且不伴有小管炎和动脉内膜炎。
CAI的发病机制还不清楚。巨噬细胞在多种肾疾病中聚集是一种普遍现象，包括炎症性、非炎症性肾疾病和移植肾损伤。研究表明巨噬细胞可以被极化成两种不同的表型，即M1和M2。M1型巨噬细胞具有促炎表型，常与组织损伤有关，而M2型巨噬细胞则是替代途径活化的巨噬细胞，被认为是抗炎表型，常与组织修复有关[5,6]。研究表明CD163阳性的M2型巨噬细胞与多种肾脏疾病的慢性损伤有关，比如在糖尿病肾病(DN)中，肾间质浸润的M2型巨噬细胞与肾间质纤维化、肾小管萎缩、DN分级和肾功能损伤有关[7]。有研究用小鼠单侧输尿管梗阻(UUO)模型来研究巨噬细胞与肾纤维化的关系，发现肾损伤后募集的巨噬细胞极化为M2型，M2型巨噬细胞可以促进肾纤维化。消除M2型巨噬细胞可特异性地抑制肾纤维化，而消除M1型巨噬细胞则无此作用[8]。这些研究显示M2型巨噬细胞与非移植肾慢性损伤的间质纤维化有关，那么M2型巨噬细胞在慢性移植肾肾损伤中是否也有同样的作用呢？一项13例儿童肾移植术后41次肾活检诊断为CAI的研究发现：CAI患者肾活检组织中M2型巨噬细胞的数量增多，并且与移植肾的间质纤维化和受者的肾功能损伤有关[2]。本研究结果显示CD163标记的M2型巨噬细胞在移植肾组织间质中的数量显著高于正常肾组织，并且随着移植肾间质纤维化程度的加重，M2巨噬细胞的数量也逐渐增多，与前述研究结果一致，说明M2型巨噬细胞在移植肾间质纤维化的进展中也起着一定的作用。
CD163是一种分子量约为130×103Da的单链跨膜糖蛋白，属于富含半胱氨酸的清道夫受体超家族，是血红蛋白-触珠蛋白复合物的清道夫受体，特异性的表达于单核巨噬细胞膜表面，其在体内有两种存在形式：一种是膜结合型，另一种是可溶性CD163，存在于血浆或其它组织液内[9]。有研究认为尿sCD163水平与活动性肾血管炎密切相关，尿sCD163是诊断活动性肾血管炎的一个明显优于尿蛋白排泄率的生物标志物[10]。Endo等[11]研究表明，狼疮性肾炎患者肾小球中浸润的细胞主要是CD163＋的M2型巨噬细胞，尿sCD163水平与肾活检组织中CD163＋的M2型巨噬细胞的数量正相关，且与狼疮性肾炎的活动度相关。但sCD163在肾移植受者尿液中的表达情况少见有人研究，我们通过ELISA法检测了CAI患者尿sCD163水平，结果发现CAI患者尿sCD163水平显著升高，并且与移植肾间质纤维化的程度有关，纤维化越重，其表达水平越高。相关性分析显示尿sCD163水平与移植肾活检组织中CD163＋的M2型巨噬细胞的数量呈正相关。随着受者血Cr和尿素氮水平的升高，尿sCD163水平和移植肾组织中CD163＋的M2型巨噬细胞的数量也逐渐升高，这说明尿sCD163水平可作为CAI患者M2型巨噬细胞依赖性的生物标志物。
M2型巨噬细胞在移植肾间质纤维化中有什么样的作用呢？有人通过小鼠肾移植模型研究显示骨髓源性的M2型巨噬细胞可以转化为SMA阳性的肌成纤维细胞，进一步促进小鼠移植肾纤维化[12]。SMA是肌成纤维细胞特异的标志蛋白，在肾损伤发生时，大量生长因子和细胞因子相互作用，促使肌成纤维细胞大量增殖、活化。急剧增加的肌成纤维细胞致使细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的合成增加，增加的ECM沉积于肾间质，正常肾组织结构被破坏、肾功能受损，最终发生间质纤维化[13]。本研究发现SMA在移植肾组织中的阳性面积显著高于正常肾组织，而且随着移植肾间质纤维化级别的升高而增大，SMA阳性面积与M2型巨噬细胞的数量具有显著的一致性，并且M2型巨噬细胞主要位于间质纤维化区域。这表明M2型巨噬细胞的聚集对移植肾间质纤维化可能起着促进作用，具体的机制有待于进一步研究。
以往关于M2型巨噬细胞在肾纤维化中的作用多集中在原发肾疾病或移植肾动物模型上，本研究初步探讨了M2型巨噬细胞在慢性移植肾肾损伤间质纤维化中的作用，结果显示M2型巨噬细胞与移植肾间质纤维化的进展有关，尿sCD163水平与移植肾活检组织中M2型巨噬细胞的数量变化一致，推测sCD163可作为CAI患者的生物标志物。因此，我们认为在临床肾移植工作中可以通过检测肾活检组织中M2型巨噬细胞的聚集情况及尿sCD163表达水平来预测CAI患者间质纤维化发生的可能性，对临床防止移植肾纤维化有着重要意义，本研究是单中心研究，样本量少，需要收集更多的样本进一步证实。
