对国际用于人胰岛制备的两种胶原酶(Serva NB1胶原酶和VitacyteGOLD胶原酶)在中国供者胰岛分离中的效果进行比较。探讨适合中国人的胰岛分离方法。
入选17例供者胰腺均来自死亡后器官捐献，其中12例使用Serva NB1胶原酶消化，5例使用Vitacyte GOLD胶原酶消化。在百级层流实验室中进行胰腺分离，经过修整，分别应用不同胶原酶充分灌注，利用Ricordi方法消化并记录消化时间，利用连续密度梯度法纯化胰岛，然后检测胰岛产率、活性和葡糖糖刺激的胰岛素分泌能力，以评估分离胰岛的数量和质量。
Vitacyte GOLD胶原酶比Serva NB1胶原酶所需的消化时间更短(P<0.05)。纯化后直径在50～100 μm之间的胰岛，Vitacyte GOLD胶原酶组明显多于ServaNB1胶原酶组(P<0.05)，直径在251～300 μm、301～350 μm之间的胰岛，Vitacyte GOLD胶原酶组明显少于ServaNB1胶原酶组(P<0.05)。两种胶原酶分离获得总胰岛数量差异无统计学意义(P>0.05)。两种胶原酶分离胰岛的活性检测和GSI结果差异无统计学意义(P>0.05)。
Serva NB1胶原酶和Vitacyte GOLD胶原酶均可用于临床分离制备中国人胰岛。
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脆性糖尿病常见于1型糖尿病和胰岛功能近乎衰竭的2型糖尿病患者[1,2]，其视网膜病变、肾病及自主神经病变并发症的发生率明显升高[3]。胰岛移植是近年来兴起的一种治疗脆性糖尿病的有效方法，具有移植手术简单、受者创伤小且治疗效果好等优势，受到广大专家学者的关注[4,5]。目前，全球近40家医疗单位完成了超过1 000例胰岛移植手术。胰岛分离的效果是决定临床胰岛移植成败的重要因素之一[6,7,8]。胶原酶的选择和使用是胰岛分离的关键步骤，决定胰岛分离的质量和数量[9]。欧美的大型胰岛研究中心都拥有自己成熟的胰岛分离方法[10]。而我国的大多数从事胰岛移植的单位所延用的分离方法及试剂选择均根据国外经验确定。由于种族差异，国外胰岛分离方式并不一定完全适用我国人群，这严重制约了胰岛移植和糖尿病研究在我国的发展。
本文通过对国际用于人胰岛制备的两种胶原酶(Serva NB1胶原酶和Vitacyte GOLD胶原酶)在我国器官捐献者胰岛分离中的效果进行研究比较，分别从胰岛消化率、纯化后的胰岛数量、纯度、活性、功能及安全性等方面进行评价。探讨适合我国人群的胰岛分离胶原酶，为我国胰岛移植在临床治疗和糖尿病基础研究方面奠定基础。
本研究中从2015年6月至2016年11月进行的17例胰岛中进行分离，胰腺均来自于天津市第一中心医院的器官捐献者。捐献者年龄为25～65岁，冷缺血时间为2～8 h。其中12例使用Serva NB1胶原酶消化，5例使用Vitacyte GOLD胶原酶消化。胰腺在低温低压下原位灌注器官保存液(UW液)。切取胰腺时保留胰腺包膜完整连同十二指肠、脾脏一并摘除并放置于0～4 ℃的UW器官保存液保存，迅速转移至百级层流实验室内。
胰腺消毒、修剪并插管后按照分组分别灌入SERVE NB1胶原酶和Vitacyte GOLD胶原酶，直至胰腺组织充分膨胀。将灌注好的胰腺组织切成8～12块后转移至Ricordi消化罐中，加热至37 ℃后机械震荡同时抽取组织，双硫腙(DTZ)染色显微镜下观察胰岛分离情况，当胰岛与外分泌组织充分分离时，终止消化，迅速灌入常温1640基础培养液，并将组织液收集至自配的缓冲溶液中。组织液离心洗涤2～3次后放入计数器中根据胰岛当量(IEQ)计数。将消化后的胰岛置于150 ml的UW液中静止30 min以上，然后在COBE2991血细胞淘洗机上以连续密度梯度离心法纯化胰岛。对胰岛大小、碎片、密度及形态进行量化评分，并于体积分数5%CO2培养箱中于22 ℃下培养、待用。
二乙酸荧光素(FDA)和碘化丙啶(PI)与一定量的胰岛悬液混合后倒置荧光显微镜下观察，计算每个视野下活细胞占总细胞数量的比率、连续观察50个视野的活性率，计算平均数和标准差。
根据β细胞在高糖刺激下分泌胰岛素的原理，本研究利用葡萄糖刺激胰岛素分泌试验(GSIS)评估胰岛功能。以每孔10个IEQ的胰岛细胞接种于24孔板，经过1 h的低糖(终浓度1.67 mmol/L)培养基预处理后，胰岛按次序被给予1 h低糖(终浓度1.67 mmol/L)培养基培养，和1 h高糖(终浓度mmol/L)培养基培养；分别收集低糖培养和高糖培养后的培养基，离心去细胞后，利用ELISA检测培养过胰岛的培养基中的胰岛素浓度，另通过超声将胰岛破碎测定胰岛素总含量(TI)，根据公式计算葡萄糖刺激指数(GSI)，并以此评价胰岛功能。
将纯化后的胰岛离心上清液和最终的胰岛成品上清液分别留样进行革兰氏染色、细菌培养、真菌培养及内毒素检测。
采用GraphPad Prism 5软件处理数据，所有数据以均数±标准差(
±s)表示，两组间比较采用独立样本t检验分析，P<0.05表示差异有统计学意义。
入选17例胰腺供者，其中12例使用Serva NB1胶原酶消化，5例使用Vitacyte GOLD胶原酶消化，两组年龄、男女比例、体重指数、胰腺重量、冷缺血时间差异均无统计学意义(P>0.05，表1)。
两组胰腺供者的基本情况(
±s)
两组胰腺供者的基本情况(±s)
| 组别 | 例数 | 年龄(岁) | 性别(%) | 胰腺重量(g) | 体重指数(kg/m2) | 冷缺血时间(h) |
|---|---|---|---|---|---|---|
| ServaNB1组 | 12 | 43.4±3.45 | 91.7(M)/8.3(F) | 75.28±15.69 | 28.29±5.46 | 4.15±0.71 |
| Vitacyte GOLD组 | 5 | 32.8±3.12 | 100.0(M)/0.0(F) | 76.32±10.22 | 24.78±2.92 | 4.20±0.68 |
| P值 | 0.4045 | 0.3070 | 0.8941 | 0.1995 | 0.8957 |
两组分别从胰腺消化时间、胰岛纯度、纯化后、纯度、活性和葡萄糖刺激试验结果方面进行比较。Vitacyte GOLD胶原酶比Serva NB1胶原酶胰岛消化时间短(P<0.05)。两种胶原酶分离获得胰岛数量差异无统计学意义(P>0.05)。活性检测和GSI结果差异无统计学意义(P>0.05，表2)。
ServaNB1胶原酶和Vitacyte GOLD胶原酶消化胰岛比较(
±s)
ServaNB1胶原酶和Vitacyte GOLD胶原酶消化胰岛比较(±s)
| 组别 | 例数 | 消化时间(min) | 纯化后胰岛当量 | 纯化后纯度(%) | 活性(%) | 葡萄糖刺激指数 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| ServaNB1组 | 12 | 11.67±3.42 | 438579.8±221132.8 | 75±4.13 | 92.0±5.02 | 2.29±1.21 |
| Vitacyte GOLD组 | 5 | 7.08±0.72 | 442941.5±335943.4 | 78±2.22 | 90.8±3.22 | 1.93±0.72 |
| P值 | 0.0105 | 0.1068 | 0.1503 | 0.6318 | 0.5482 |
注：GSI为葡萄糖刺激指数，IEQ为胰岛当量
纯化后直径在50～100 μm之间的胰岛，Vitacyte GOLD胶原酶组多于ServaNB1胶原酶组，且差异有统计学意义(P<0.05)；直径在251～300 μm、301～350 μm之间的胰岛，Vitacyte GOLD胶原酶组少于ServaNB1胶原酶组，且差异均有统计学意义(P<0.05，表3，图1)。
纯化后胰岛体积分布百分比比较(
±s)
纯化后胰岛体积分布百分比比较(±s)
| 组别 | 胰岛分布范围(μm) | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 50～100 | 101～150 | 151～200 | 201～250 | 251～300 | 301～350 | 351～400 | >400 | |
| ServaNB1组(%) | 8.75±5.66 | 11.33±6.21 | 1.03±4.11 | 13.68±6.55 | 21.67±9.34 | 15.389±17.6 | 13.21±16.58 | 4.74±11.73 |
| Vitacyte GOLD组(%) | 43.85±15.97 | 21.75±2.51 | 7.34±4.85 | 15.51±7.95 | 1.72±3.45 | 3.53±4.46 | 3.23±6.47 | 3.10±6.21 |
| P值 | 0.005 | 0.002 | 0.015 | 0.628 | 0.003 | 0.167 | 0.218 | 0.774 |
胰岛移植作为新型的治疗脆性糖尿病的手段之一，受到国际众多专家学者的认可[11]。目前，国内已开展胰岛移植的机构屈指可数，由于胰岛分离提取对技术的要求比较高，以致各家单位的胰岛获得率不甚相同，有的甚至花费较高，但分离效果不佳获取的胰岛无法进行临床胰岛移植。如何获取足够的高质量胰岛是临床胰岛移植成功与否的技术关键。
胰岛分离获取胰岛的质和量直接决定是否可以进行临床胰岛移植及临床胰岛移植效果，其中胶原酶的选择和使用尤为重要[12]。国际多家胰岛研究中心均有对两种以上胶原酶进行比较的报道[13]。其中也包括对ServaNB1胶原酶和Vitacyte GOLD胶原酶两种酶的比较，O’Gorman等[14]研究评价ServaNB1胶原酶有较好的胰岛分离效果，而Caballero-Corbalán等[15]认为Vitacyte GOLD胶原酶可以降低分离过程中胰岛的损失，提高胰岛分离效率，各家报道结果不尽相同。考虑到种族差异、生活方式及环境的不同，国外数据并不一定适用于我国。本次研究在保证捐献者基本情况、胰腺灌注液，冷缺血时间基本相同的条件下分别从胰岛消化时间、消化率、纯化后的胰岛数量(IEQ)、胰岛数量分布、胰岛纯度、活性、功能及安全性等方面进行比较发现：(1)Vitacyte GOLD胶原酶比Serva NB1胶原酶消化胰岛时间明显短。这跟Iglesias等[16]的报道结果一致，Vitacyte GOLD胶原酶能够显著缩短胰岛从腺泡组织释放出来的时间，消化速度快可以使胰岛细胞迅速脱离消化过程中的有害环境，减少损伤[17]。但是在胰岛分离的实际操作过程中，我们需要随时抽取消化样本镜下观察消化情况来判断消化终止时间。消化速度过快将导致无法及时终止而消化过度，从而影响胰岛质量。我们可以通过降低消化酶的浓度，适当降低消化速度，避免过度消化情况的发生。(2)尽管两种胶原酶分离纯化胰岛的数量差异无统计学意义，但我们发现，胰岛大小的分布情况并不相同，纯化后直径在50～100 μm之间的胰岛，Vitacyte GOLD胶原酶组明显多于ServaNB1胶原酶组，纯化后直径在251～300 μm、301～350 μm之间的胰岛，Vitacyte GOLD胶原酶组明显少于ServaNB1胶原酶组。根据以往多篇文献报道，小体积胰岛功能可能更优于大体积胰岛，如：Lehmann等[18]研究表明在胰岛素分泌研究中小体积胰岛的胰岛素分泌明显高于大体积胰岛，Papas等证明较小体积的胰岛扩散屏障更小能够迅速有效地对葡萄糖浓度做出反应[19]，Nam等[20]发现小体积胰岛对葡萄糖刺激分泌胰岛素更敏感。另外从生理学角度看，β细胞分泌胰岛素需要血管依赖和神经调节，胰岛分离的过程将会破坏胰岛周围血管神经。而胰岛移植后的再次血管化一般需要10～14 d[21]，移植后早期胰岛主要通过扩散获得氧和营养物质。扩散障碍对较小体积胰岛获得氧气和营养物质的影响更小，在缺氧环境下存活的概率比大体积胰岛高[22]。Daria等[23]通过小鼠实验研究证明小体积胰岛移植后降糖效果明显优于大体积胰岛，源于小体积胰岛更容易快速完成血管化过程。鉴于以上研究，表明相同IEQ数量的胰岛，胰岛体积不同，得到的胰岛移植效果也不同。Vitacyte GOLD胶原酶组纯化获得小体积胰岛较ServaNB1胶原酶组多，提示移植后效果可能优于ServaNB1胶原酶组。(3)我们研究中的全部样本均进行生物安全性评估：包括胰岛培养液的革兰染色、细菌真菌培养、内毒素检测。结果显示革兰染色、细菌培养、真菌结果均为阴性，内毒素检测均<0.05 Eu/ml。表明两种胶原酶均达到生物安全性标准，可以用于临床胰岛分离。
本次研究对两种胶原酶的结果分析表明，两种胶原酶均可用于临床胰岛分离。
下一步我们将通过适当降低Vitacyte GOLD胶原酶浓度获得更好的消化效果。同时增加样本量及体内实验进一步评价Vitacyte GOLD胶原酶与ServaNB1胶原酶胰岛功能，验证胶原酶的效果。通过胰岛分离获得足量的高质量胰岛促进我国在糖尿病研究和治疗方面的发展。
