探讨儿童亲属活体肝移植受者中影响他克莫司血药浓度的因素，为他克莫司在儿童受者中的个体化用药提供参考。
共收集100例儿童亲属活体肝移植受者术后3、5、7、14 d及术后1、2和3个月时他克莫司的给药剂量、浓度谷值(C0)、年龄、性别、体重、供者和受者CYP3A5基因型、红细胞比容(HCT)以及肝、肾功能相关指标等，以浓度与剂量比值(C0/D)为因变量，用多元逐步回归方法分析他克莫司血药浓度的影响因素。
术后3 d时影响血他克莫司浓度的因素为受者CYP3A5基因型、供者CYP3A5基因型及受者体重；术后5 d时主要影响因素有供者和受者CYP3A5基因型、受者体重和HCT；术后7 d时为供、受者CYP3A5、受者年龄和HCT；术后14 d与2个月时的影响因素相同，主要有受者体重和CYP3A5基因型；术后1个月时为受者体重、受者CYP3A5基因型及碱性磷酸酶(ALP)；术后3个月时为受者CYP3A5基因型和体重。对供、受者CYP3A5基因型作进一步研究，受者CYP3A5基因型非表达组受者的C0/D比值明显高于表达组，供者CYP3A5基因型非表达组受者的C0/D比值明显高于表达组。
肝移植术后不同时间影响血他克莫司浓度的因素不尽相同，密切关注供、受者CYP3A5基因型、受者体重及相关生化指标的变化情况，综合考虑各种影响因素进行个体化用药以改善儿童受者预后。
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目前，他克莫司是实体器官移植一线免疫抑制药物，其治疗窗窄(5～15 μg/L)，药代动力学个体差异大，尤其在儿童受者中，药代动力学参数和血药浓度会发生较大变异[1,2,3,4]。且儿童肝移植受者免疫系统发育尚不完全，据报道，超过50%的儿童肝移植受者使用他克莫司时会出现急性排斥反应和肾毒性等不良反应[5]。维持血他克莫司浓度在治疗窗内，是预防移植术后早期排斥反应的关键。国内外对于在低龄儿童亲属活体肝移植受者术后应用他克莫司的相关报道较少，本文中我们综合分析了婴幼儿亲属活体肝移植受者中血他克莫司浓度的影响因素，以期为他克莫司在该类儿童受者中的合理应用提供参考。
入选标准：(1)2015年11月至2018年1月在天津市第一中心医院接受亲属活体肝移植的儿童受者；(2)所有受者接受肝移植时为年龄<2岁的婴幼儿；(3)术后采用以他克莫司为基础的免疫抑制方案；(4)术后随访时间大于3个月。排除标准：(1)研究时间点发生漏服他克莫司、喂药时呕吐或发生腹泻；(2)服用他克莫司少于3个月或中途更换免疫抑制方案；(3)使用显著影响他克莫司血药浓度的药物(如CYP3A酶诱导剂苯妥英钠、利福平以及CYP3A酶抑制剂西咪替丁、氟康唑等)；(4)随访期内发生排斥反应以及严重腹水或感染。
共100例受者纳入本研究，其中男性48例，女性52例，年龄7.7个月(4.43～21.5个月)，体重(7.36±1.28)kg，原发病为胆道闭锁99例及慢性肝内胆汁淤积症1例。本研究符合医学伦理学标准，并得到医院伦理委员会的批准。
所有受者术后均采用他克莫司联合甲泼尼龙的二联免疫抑制方案，可加用吗替麦考酚酯。术后24 h内开始给予他克莫司，初始剂量为0.1～0.15 mg·kg-1·d-1，分两次口服，随后根据血他克莫司浓度调整剂量，使其血药浓度维持在有效浓度范围内(术后1个月内为8～12 μg/L，3个月内为7～10 μg/L)。术中一次性给予甲泼尼龙10 mg/kg，术后第1天静脉滴注30 mg/d，随后几天递减，至术后第5天减量至10 mg/d，第6天后改为口服8 mg/kg，在术后3个月至半年内逐渐停用。
收集术后3、5、7、14 d以及术后1、2和3个月时他克莫司的给药剂量、血药浓度谷值(C0)、年龄、性别、体重、红细胞比容(HCT)、白蛋白(ALB)、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、γ-谷氨酰转肽酶(γ-GGT)、碱性磷酸酶(ALP)、总胆红素(TBIL)、血清肌酐，计算剂量/体重比(D/W，单位mg·kg﹣1·d﹣1)和校正体重后的浓度剂量比[C0/D，单位(μg/L)/(mg·kg﹣1·d﹣1 )]。
术前分别收集供、受者外周血于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，用试剂盒(Zymo Research Genomic DNA Ⅱ Kit，USA)提取DNA，采用Sanger测序法检测供、受者CYP3A5*3基因型。引物序列：正向引物：5'-GAAGCAAGTGGGAGAAAG-3'；反向引物：5'-TGATGAAGGGTAATGTGG-3'。
使用SPSS(23.0版)进行统计处理。所得数据以均数±标准差(Mean±SD)表示，以C0/D为因变量，利用多元逐步回归方法对术后3、5、7、14 d及术后1、2和3个月时受者相关临床数据等可能影响血他克莫司浓度的因素进行分析，检验水平α＝0.05，P<0.05为差异有统计学意义。组间比较时符合正态分布的数据以Mean±SD表示，两组间比较用独立样本t检验，不符合正态分布的数据以中位数(范围)表示，两组间比较用曼-惠特尼U检验，P<0.05为差异有统计学意义。
术后3个月内，他克莫司初始剂量为(0.10±0.03)mg·kg﹣1·d﹣1，术后14 d内剂量逐渐增加，14 d至2个月时维持在较稳定的水平，2个月时达到最大值(0.23±0.09)mg·kg﹣1·d﹣1，在3个月时剂量略有下降。血他克莫司浓度在术后7 d内呈上升趋势，随后略有波动(表1)。
术后3个月内他克莫司给药剂量及血药浓度谷值(C0)
术后3个月内他克莫司给药剂量及血药浓度谷值(C0)
| 术后时间 | 例数 | 剂量(mg·kg﹣1·d﹣1) | C0(μg/L) |
|---|---|---|---|
| 1 d | 99 | 0.10±0.03 | — |
| 3 d | 100 | 0.13±0.05 | 6.36±3.57 |
| 5 d | 100 | 0.17±0.08 | 7.24±3.95 |
| 7 d | 100 | 0.19±0.10 | 7.58±3.58 |
| 14 d | 100 | 0.22±0.10 | 7.07±3.27 |
| 1个月 | 98 | 0.22±0.09 | 6.78±2.89 |
| 2个月 | 96 | 0.23±0.09 | 7.02±2.31 |
| 3个月 | 88 | 0.19±0.09 | 6.79±2.39 |
对血他克莫司浓度影响因素的多元逐步回归分析显示，术后不同时间影响他克莫司血药浓度的因素各不相同。术后3 d时为供、受者CYP3A5基因型及受者体重；术后5 d时为供、受者CYP3A5基因型及受者体重和HCT；术后7 d时为供、受者CYP3A5基因型及受者年龄和HCT；术后14 d时与术后2个月时影响因素相同，主要有受者体重和CYP3A5基因型，术后1个月时为受者体重、CYP3A5基因型及ALP；术后3个月时为受者CYP3A5基因型和体重(表2)。
术后不同时间他克莫司血药浓度的影响因素的多元逐步回归结果
术后不同时间他克莫司血药浓度的影响因素的多元逐步回归结果
| 术后时间 | 影响因素 | 影响因素 | 影响因素 | 影响因素 | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 因素 | P值 | 因素 | P值 | 因素 | P值 | 因素 | P值 | |
| 3 d | 受者CYP3A5 | 0.000 | 体重 | 0.002 | 供者CYP3A5 | 0.012 | ||
| 5 d | 供者CYP3A5 | 0.000 | 体重 | 0.000 | 受者CYP3A5 | 0.001 | 红细胞比容 | 0.001 |
| 7 d | 受者CYP3A5 | 0.000 | 受者CYP3A5 | 0.000 | 年龄 | 0.011 | 红细胞比容 | 0.045 |
| 14 d | 体重 | 0.000 | 受者CYP3A5 | 0.006 | ||||
| 1个月 | 体重 | 0.000 | 受者CYP3A5 | 0.006 | 碱性磷酸酶 | 0.013 | ||
| 2个月 | 体重 | 0.000 | 受者CYP3A5 | 0.001 | ||||
| 3个月 | 受者CYP3A5 | 0.011 | 体重 | 0.043 | ||||
根据是否表达CYP3A5基因型，将受者分为表达组和非表达组。受者CYP3A5*1等位基因发生率为33.5%，CYP3A5*3发生率为66.5%。比较术后各时点他克莫司C0/D比，非表达组受者的C0/D明显高于表达组，差异有统计学意义(P<0.05，表3)。
受者CYP3A5基因型分组及不同受者CYP3A5基因型组受者术后不同时间的他克莫司C0/D比
受者CYP3A5基因型分组及不同受者CYP3A5基因型组受者术后不同时间的他克莫司C0/D比
| 组别 | 基因型 | 例数 | 年龄(月) | 体重(kg) |
|---|---|---|---|---|
| 表达组 | CYP3A5*1*1/CYP3A5*1*3 | 60(4/56) | 7.52(4.43～21.5) | 7.36±1.13 |
| 非表达组 | CYP3A5*3*3 | 40 | 7.84(4.57～17.47) | 7.36±1.48 |
| 组别 | 例数 | 他克莫司C0/D比[(μg/L)/(mg﹣1·kg﹣1·d﹣1)] | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 术后3 d | 术后5 d | 术后7 d | 术后14 d | 术后1个月 | 术后2个月 | 术后3个月 | ||
| 表达组 | 60 | 33.83(6.00，102.40) | 28.58(6.20，167.20) | 30.71(4.13，131.20) | 25.87(7.20，91.43) | 22.42(6.40，103.68) | 26.65(6.40，119.88) | 32.57(12.68，184.68) |
| 非表达组 | 40 | 81.02±37.07 | 71.63±40.11 | 58.78(15.08，280.00) | 39.76(11.99，216.46) | 41.69(9.10，141.82) | 37.25(12.38，164.28) | 43.89(12.76，114.86) |
| P值 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | 0.002 | 0.014 | |
同样，根据是否表达CYP3A5基因型，将供者分为表达组和非表达组。供者CYP3A5*1等位基因发生率为30.0%，CYP3A5*3发生率为70.0%。比较术后3、5、7时受者的他克莫司C0/D比，结果显示，供者CYP3A5非表达组受者的C0/D比显著高于表达组，差异有统计学意义(P<0.05，表4)。
供者CYP3A5基因型分组及不同供者CYP3A5基因型组受者术后不同时间的他克莫司C0/D比
供者CYP3A5基因型分组及不同供者CYP3A5基因型组受者术后不同时间的他克莫司C0/D比
| 组别 | 基因型 | 例数 | 年龄(月) | 体重(kg) | 他克莫司C0/D比[(μg/L)/(mg·kg﹣1·d﹣1)] | ||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 术后3 d | 术后5 d | 术后7 d | |||||
| 表达组 | CYP3A5*1*1/ CYP3A5*1*3 | 52(6/46) | 7.00(4.43～21.5) | 7.37±1.21 | 35.72(6.00，143.00) | 25.90(6.20，167.20) | 29.54(4.13，131.20) |
| 非表达组 | CYP3A5*3*3 | 48 | 8.27(5～17.47) | 7.35±1.36 | 68.44±35.57 | 69.39±38.29 | 61.19(16.08，280.00) |
| P值 | 0.000 | 0.000 | 0.000 | ||||
他克莫司药代动力学个体差异大，临床难以建立个体化治疗方案，特别是在儿童肝移植受者中，维持血他克莫司浓度在有效范围内，是术后管理中的棘手问题[2,6]。了解影响其在儿童受者中血药浓度的因素对于采用稀疏采样策略建立最佳剂量的方案至关重要。本研究通过分析与总结儿童肝移植受者的年龄、体重、HCT、肝功能指标、药物代谢酶的基因多态性以及术后不同时间他克莫司的用量与血药浓度等临床资料，探讨了儿童肝移植受者术后不同时间他克莫司血药浓度的影响因素。
分布于肝脏与小肠的细胞色素P450酶(CYP)在他克莫司的代谢方面起着关键作用[7,8]。其中，CYP3A5对他克莫司代谢的贡献率高达60%[2,9,10,11]。据报道，肝移植受者和供者CYP3A5基因型均是影响术后他克莫司药代动力学变异的重要因素[8,12]。在本研究中，随着术后时间的变化，受者与供者的CYP3A5基因型都是影响儿童肝移植受者术后他克莫司血药浓度的因素，特别是受者CYP3A5基因型的影响包含在整个研究周期内。本研究中，供者CYP3A5基因型仅在术后3、5、7 d时是影响血他克莫司浓度的因素，与Philippe等[13]的发现一致。以往研究指出，受者肠道CYP3A5基因多态性比肝脏有更重要的作用，我们的研究中受者CYP3A5基因型的影响可能也是由受者肠道代谢酶活性引起。术后早期阶段供者CYP3A5基因型的影响可能由于移植术后受者各项功能不能马上恢复，而成人CYP酶更成熟，此时供者CYP3A5酶发挥主要作用，随着受者功能的恢复，其自身代谢酶的活性占主导地位。
已有研究表明，血他克莫司浓度谷值达到稳态时，CYP3A5基因型表达者(CYP3A5*1*1或CYP3A5*1*3)的他克莫司日剂量较非表达者(CYP3A5*3*3)高1.5～2倍[13]。本研究中我们发现，受者CYP3A5基因型非表达组的他克莫司C0/D比值较表达组平均高1.75倍，与Xue等[2]的研究结果相似。在对供者CYP3A5基因型是否表达与他克莫司C0/D比值的关系进行研究时，发现在术后3、5、7 d时供者CYP3A5基因型表达组受者的C0/D显著低于非表达组受者。因此，供者和受者的CYP3A5基因多态性对他克莫司在儿童肝移植受者中的合理应用均有重要意义，临床应根据供者和受者不同CYP3A5基因型进行个体化给药。
儿童生长发育快，随着肝移植术后时间的延长，受者体重也不断增加。Musuamba等[5]的研究中，受者体重不仅影响他克莫司的清除率，还影响其表观分布。在本研究中，受者体重是影响血他克莫司浓度的主要因素。研究表明，与年长的受者相比，年龄较小受者达到相同他克莫司治疗窗浓度需要更高的他克莫司剂量[≤1岁受者的剂量为(0.24±0.17)mg·kg﹣1·d﹣1与>5岁受者的剂量为(0.14±0.10)mg·kg﹣1·d﹣1][13]。而在本研究中，年龄仅在术后7 d时是影响C0/D比的因素，可能与我们研究的人群年龄相对集中有关。
他克莫司广泛与红细胞结合，HCT的改变将影响他克莫司在红细胞和血浆之间的相对分布[14,15]。低HCT值增加游离他克莫司的比例，游离他克莫司容易被肝脏代谢，导致清除率增加。此外，肝肾功能的改变也会影响他克莫司的代谢[16]。研究表明，肝功能受损时，他克莫司的半衰期较长，清除率降低，浓度升高[15]。本研究中，ALP在术后1个月时显著影响血他克莫司浓度。
本研究是单中心研究，且随访时间偏短，未能将合并用药等更全面的因素进行研究，还需对术后更长时间的影响做更深入的研究。总之，本研究表明，临床上多种因素都可能对儿童亲体肝移植患者术后他克莫司的血药浓度造成影响，且术后不同时期的主要影响因素略有不同。此外，无论供者还是受者，与CYP3A5基因型非表达者相比，CYP3A5基因型表达者达到目标浓度时需要更高剂量的他克莫司，CYP3A5基因多态性对他克莫司在儿童亲属活体肝移植受者中的合理应用具有重要意义。因此，术前应检测供、受者CYP3A5基因型，术后应密切关注受者体重及生化指标的变化情况，综合考虑各种影响因素，从而达到最佳的治疗效果。
