探讨基于宏基因组学的二代测序技术(mNGS)在肾移植术后重症肺炎诊治中的应用价值。
以解放军第九〇〇医院2017年10月至2018年12月收治的38例肾移植术后重症肺炎受者为研究对象，根据是否行肺泡灌洗液(BALF)mNGS检测病原微生物，分为实验组(A组，15例)，对照组(B组，23例)，比较两组病原学检测阳性率、临床采信率及住院天数、住院费用和病死率等指标。
实验组mNGS法病原学检测阳性率、临床采信率高于实验组传统法和对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，实验组住院天数、住院费用、28天病死率均小于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，两组90天病死率差异无统计学意义(P>0.05)。
肾移植术后重症肺炎受者BALF行mNGS检测，可提高病原学检测阳性率、临床采信率，减少住院天数，降低住院费用和28天病死率。
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肾移植术是终末期尿毒症的主要治疗手段之一。肾移植术后因长期服用免疫抑制剂，受者免疫力低下，容易合并机会性感染[1]。肺部感染发生率9 %～16 %，是肾移植术后受者最常见的感染[2,3]，并常导致死亡[4] ，特别是混合感染的死亡率达50 %[5]，短时间内明确病原微生物是治疗的关键。传统培养、革兰氏染色、免疫检测和核酸检测等效率较低，其准确性和及时性欠缺，不利于指导抗感染[6]。基于宏基因组学的二代测序技术(metagenomic next-generation sequencing，mNGS)是新一代的病原微生物鉴定方式。2010年开始，mNGS从实验室过渡到临床[7]。该技术直接对核酸序列进行比对，可能有助于提高肾移植术后重症肺炎受者病原微生物检测的阳性率，进而指导治疗，改善其预后。基于上述考虑，我科开展了本项研究，以探讨肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)mNGS检测在肾移植术后重症肺炎诊治中的应用价值。
收集解放军第九〇〇医院2017年10月至2018年12月收治的肾移植术后长期口服免疫抑制剂后罹患重症肺炎入院的受者为研究对象。排除儿童、孕妇、哺乳期以及非感染性肺炎、心源性肺水肿的受者，共收集38例，随机分为实验组(A组，15例)入院24 h内行气管镜检查，留取BALF行mNGS检测，同时也送检传统的病原学检测项目，包括BALF行革兰氏染色及细菌、真菌培养，抽血查1，3-β-D葡聚糖(1，3-beta-D-glucan，G)试验、半乳甘露聚糖(galactomannan，GM)试验、呼吸道病原抗体谱、肺炎支原体血清学试验、隐球菌荚膜抗原、曲霉菌抗体、细胞病毒抗体IgG/IgM及DNA、血培养，对照组(B组，23例)只行传统方法检测，其中实验组男11例，女4例，中位年龄40.9岁(27～59)岁，中位检测时间为肾移植术后50.7个月(3.6～145)个月。对照组男18例，女5例，中位年龄45.3岁(25～69)岁，中位检测时间为肾移植术后62.4(2.6～170.2)个月。两组受者的一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。重症肺炎诊断标准采取中华医学会呼吸病学分会《中国成人社区获得性肺炎诊断和治疗指南(2016年版)》[8]中重症肺炎的诊断标准：符合下列1项主要标准或≥3项次要标准者可诊断为重症肺炎。主要标准：(1)需要气管插管行机械通气治疗；(2)脓毒症休克经积极液体复苏后仍需要血管活性药物治疗。次要标准：(1)呼吸频率≥30次/min；(2)氧合指数≤250 mmHg；(3)多肺叶浸润；(4)意识障碍和(或)定向障碍；(5)血尿素氮≥7.14 mmol/L；(6)收缩压<90 mmHg需要积极的液体复苏。
两组受者入院后即经验性给予抗革兰氏阳性(G＋)菌、抗革兰氏阴性(G-)菌、抗真菌、抗病毒的广谱抗感染策略。入院后24 h内行纤维支气管镜检查，留取BALF，对照组只行传统方法检测，实验组行BALF的mNGS及传统方法检测。其中肺泡灌洗规定灌洗部位：根据影像学选取肺炎最明显的叶段。方法：一次性快速推注10 ml生理盐水，保留15s后，用200 mmHg的负压回收3 ml以上BALF于标本管中。交由深圳华大基因股份有限公司收集和检测，与该公司病原数据库进行比对，得出报告结果序列数。根据两组检测结果，如能明确病原微生物，则判定结果可采信，并据此结果调整抗感染方案为靶向治疗，如不能明确病原微生物，则判定结果不采信，并给予经验性治疗，视用药效果调整抗感染方案。
根据mNGS结果中某类病原微生物序列数个数为评价指标，如检出某种(些)病原微生物序列数的，则判定检测结果为阳性。传统方法中有一项阳性，则判定检测结果为阳性。比较A组mNGS法，A组传统法和B组病原微生物检出阳性率，及临床采信度(临床认定阳性结果有意义并调整为靶向治疗的比例)，同时比较两组受者住院天数、住院费用、28 d病死率、90 d病死率。
应用SPSS22.0统计学软件进行数据处理和分析，计量资料用均数±标准差(Mean±SD)表示，组间比较采用t检验；计数资料采用率表示，组间比较采用χ2检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。
A组mNGS法检测出G＋菌4例(26.7 %)，G-菌10例(66.7 %)，耶氏肺孢子菌3例(20.0 %)，病毒3例(20.0 %)，真菌0例，其他1例(6.7 %)，两项以上检出阳性的5例(33.3 %)。A组传统法BALF培养阳性3例(20.0 %)，涂片阳性6例(40.0 %)，G/GM试验阳性2例(13.3 %)，细胞病毒抗体IgG/IgM或病毒DNA阳性3例(20.0 %)，余项目检出无阳性，两项以上检出阳性的2例(13.3 %)。B组BALF培养阳性11例(47.8 %)，涂片阳性10例(43.5 %)，G/GM试验阳性6例(26.1 %)，呼吸道病源抗体谱阳性1例(4.3 %)，细胞病毒抗体IgG/IgM或病毒DNA阳性6例，(26.1 %)，余项目检出无阳性，两项以上检出阳性的12例(52.2 %，表1)。
两组传统方法检测结果分布[例(%)]
两组传统方法检测结果分布[例(%)]
| 组别 | 例数 | BALF培养 | BALF涂片 | G/GM试验 | 呼吸道病原抗体谱 | 肺炎支原体血清学试验 | 隐球菌荚膜抗原 | 曲霉抗体 | 细胞病毒抗体IgG/IgM或病毒DNA | 血培养 | 两项及以上 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| A组 | 15 | 3(20.0%) | 6(40.0%) | 2(13.3%) | 0 | 0 | 0 | 0 | 3(20.0%) | 0 | 2(13.3%) |
| B组 | 23 | 11(47.8%) | 10(43.5%) | 6(26.1%) | 1(4.3%) | 0 | 0 | 0 | 6(26.1%) | 0 | 12(52.2%) |
A组mNGS法检测结果为阳性的15例，阳性率100 %，A组传统法检测结果为阳性的9例，阳性率60.0 %，B组检测结果阳性16例，阳性率69.6 %，A组mNGS法的阳性率高于同组传统法和B组，差异有统计学意义(P<0.05)，A组传统法阳性率与B组差异无统计学意义(P>0.05)。
A组mNGS法有4例未采信，原因为检出序列数较少，病原种类多且分散，再结合临床(病史、影像、症状、其他等)，无法分辨致病菌、定植菌、污染菌。A组传统法和B组不采信原因为结合临床后，考虑与临床不符，包括考虑BALF培养到呼吸道定植菌或病毒IgG阳性，但病毒IgM和DNA阴性，无法判断是否病毒感染，或G/GM试验呈弱阳性，无法判断是否真菌感染等情况。综上所述，A组mNGS法无法明确病原体4例(26.7 %)，可明确病原体11例，包括G＋菌3例(20.0 %)，G-菌7例(46.7 %)，耶氏肺孢子菌3例(20.0 %)，病毒2例(13.3 %)，混合感染4例(26.7 %)；A组传统法无法明确病原体11例(73.3 %)，可明确病原体4例，包括G＋菌2例(13.3 %)，G-菌2例(13.3 %)，病毒1例(6.7 %)，混合感染1例(6.7 %)；B组无法明确病原体19例(82.6 %)，可明确病原体4例，包括G＋菌2例(8.7 %)，G-菌2例(8.7 %)，真菌1例(4.3 %)，病毒2例(8.7 %)，混合感染2例(8.7 %，表2)。A组采信mNGS结果11例，采信率73.3 %，传统法采信4例，采信率26.7 %，A组mNGS法采信率高于本组传统法和B组，差异有统计学意义(P<0.05)，A组传统法采信率与B组差异无统计学意义(P>0.05)。
两组两方法明确病原体情况[例(%)]
两组两方法明确病原体情况[例(%)]
| 组别 | n | G＋菌 | G-菌 | 真菌 | 耶氏肺孢子菌 | 病毒 | 其他 | 混合 | 不明 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| A组mNGS法 | 15 | 3(20.0%) | 7(46.7%) | 0 | 3(20.0%) | 2(13.3%) | 0 | 4(26.7%) | 4(26.7%) |
| A组传统法 | 15 | 2(13.3%) | 2(13.3%) | 0 | 0 | 1(6.7%) | 0 | 1(6.7%) | 11(73.3%) |
| B组 | 23 | 2(8.7%) | 2(8.7%) | 1(4.3%) | 0 | 2(8.7%) | 0 | 2(8.7%) | 19(82.6%) |
A组28 d内死亡0例，90 d内死亡1例(此例受者因治疗费用原因放弃治疗，出院后7 d家中死亡)，病死率6.7 %，B组28 d内死亡6例，病死率26.1 %，90 d内死亡7例，死亡率30.4 %，A组28 d病死率低于B组，差异有统计学意义(P<0.05)，两组90 d病死率差异无统计学意义(P>0.05)。
A组的平均住院天数(14.73±6.26)d，小于B组的(22.52±8.22)d，差异有统计学意义(P＝0.002)；其治疗费用(53430.41±29457.34)元也低于B组的(93515.51±45246.03)元，差异有统计学意义(P＝0.005)。
肾移植术后重症肺炎常起病隐匿，进展迅速[9]，感染的常见病原微生物包括细菌、真菌、病毒、耶氏肺孢子菌、支原体、结核杆菌等[10]，病原微生物呈多样性，多为混合感染[11]。本研究结果也证实细菌、真菌、病毒、耶氏肺孢子菌等为肾移植术后重症肺炎常见的病原微生物，部分为混合感染。受者入院后通常行广谱抗感染治疗(抗细菌、真菌、病毒，必要时同时抗耶氏肺孢子菌、衣原体、支原体)，后续再根据病原微生物检测结果，进一步调整成针对性的抗感染治疗[12]。是否能尽快明确病原微生物类型，是肾移植术后重症肺炎受者治疗的关键。
传统的微生物检测技术，时效性、敏感性、特异性不理想[13]，特别是细菌培养易受正常菌群的干扰[14]，抗感染药物的使用对传统方法检测结果也有一定影响。研究表明，受培养条件限制，99 %以上的病原微生物无法在现有的实验室条件下进行培养，大多数肾移植术后重症肺炎受者为混合感染，培养有难度。本研究实验组传统法、对照组检测结果阳性率明显低于A组mNGS法，同时B组根据阳性检测结果调整为靶向治疗的比率也明显低于实验组，这也证实了传统方法的阳性率低，假阳性率高，影响了临床医生对检测结果的采信。mNGS技术能同时对几十万到几百万条DNA分子进行测序，并可实现对同一物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析[14]，它直接提取标本中的全部核酸片段并加以检测，将微生物专用数据库参考病原微生物序列与标本序列进行比对和智能化算法分析，分别得出与各种参考病原微生物有相同序列数的个数，避免了难培养的病原微生物的漏检，也避免培养的假阳(阴)性等[15]。它的特点为检测速度快、准确率高、覆盖度广等，抗感染药物对其结果的影响也较小[16], mNGS检出潜在致病微生物，在速度和敏感度上也具有优势[17]，mNGS为明确病原微生物的类型提供了较好的技术支持。在呼吸系统感染性疾病中，mNGS已经应用于包括痰、咽拭子、肺泡灌洗液等的病原微生物检测，并有良好的诊断意义[18,19]。本研究中实验组mNGS法的病原微生物检出阳性率高于本组传统法和对照组，证实mNGS有助于提高此类受者病原微生物检测的阳性率。同时实验组根据mNGS法的检测结果调整为靶向治疗的比率明显高于同组传统法和对照组，证实mNGS结果更易被临床医生采信。
本研究根据mNGS检测结果及时调整抗感染方案，获得满意疗效，对比传统方法，实验组降低了住院费用，缩短了住院天数，减少了28天病死率。已有研究表明，通过mNGS早期明确病原微生物后，临床据此结果调整受者抗感染方案，可改善重症肺炎受者的病死率。另有报道称，结合mNGS结果指导治疗，重症肺炎受者28天和90天的存活率均有提高，90天存活率更是从57.7 %提高到83.3 %。因此考虑mNGS可能间接降低此类受者病死率。
尽管mNGS在阳性率、采信率、改善预后等方面存在优势，但仍存在无法明确背景菌、定植菌、污染菌、致病菌等情况。本研究中实验组mNGS方法不采信的4例均因无法判定是否为致病菌。且目前的mNGS技术无法同步给出相应的药敏结果，故采信结果后只能经验性调整抗感染方案；mNGS技术作为新型的病原微生物检测技术，费用较传统病原微生物检测技术昂贵，难以实现多次送检，对于病情反复，治疗期间合并新的院内感染的受者，难以通过本方法监测致病菌的变化。
综上所述，在肾移植术后重症肺炎的诊治中，BALF mNGS检测可提高阳性率和临床采信率，减少住院天数，节约费用，对肾移植术后重症肺炎受者预后的改善有重要的价值，它作为一种新的检测手段，仍存在局限性，有赖于技术的进一步完善，以更好的为患者服务。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
