应用血浆蛋白质组学方法建立诊断模型，探索诊断和识别肾移植临床几乎耐受的新方法。
收集2011年11月至2012年11月来自华中科技大学同济医学院附属同济医院等多家医疗机构的43例受试者血浆样本。分为临床几乎耐受组(18例)、排斥反应组(12例)以及健康对照组(13例)。应用表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)技术对血浆样本进行蛋白质组学分析。使用Biomarker Wizard及Biomarker Patterns软件筛选差异质谱峰，建立诊断模型。通过检索SWISS-PROT及TrEMBL数据库，对模型节点质谱峰进行鉴定。
获得差异蛋白质谱峰21个(P<0.05)。建立由M2 565.15、M1 966.28、M6 674.78、M1 103.27，M1 716.69、M1 966.28五个质谱峰构成的诊断模型。模型诊断临床几乎耐受的敏感性为83.3%、特异性为92.0%、ROC曲线下面积为0.951。模型节点质谱峰的生物信息学鉴定结果为：B型利钠肽(ANFB)、黑色素浓集激素(MCH)、三叶因子1(TFF1)、强啡肽原(PDYN)、蛋白酶体激活亚3(PSME3)。
通过血浆蛋白质组学方法建立诊断模型能够有效识别肾移植临床几乎耐受者。
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诱导移植免疫耐受，是避免肾移植排斥反应、延长受者存活时间的有效途径，但目前尚缺乏理想的方法。临床实践中发现部分移植受者由于各种原因停用免疫抑制剂，但移植物功能却能长期维持稳定，这种现象被称为"临床操作性耐受"[1,2]。而"几乎耐受"是指仅需少量免疫抑制剂便能维持不发生排斥反应[3,4]。本研究中统一使用"临床几乎耐受"来表达上述两种概念。目前，仍然缺乏对临床几乎耐受进行诊断和预测的理想指标[5]。蛋白质组学分析能够大规模获取生物样本中的蛋白质信息能够多有效避免单一指标的不足。本研究采用表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)技术对肾移植临床几乎耐受、排斥反应病例及健康对照者血浆样本进行蛋白质组学分析，筛选差异蛋白质，并建立诊断模型。以期早期识别临床几乎耐受者，从而有利于制定更有效的个体化免疫治疗方案。
收集2011年11月至2012年11月来自华中科技大学同济医学院附属同济医院等多家医疗机构的43例受试者血浆样本。分为临床几乎耐受组(18例)、排斥反应组(12例)及健康对照组(13例)。其中排斥组来自华中科技大学同济医学院附属同济医院器官移植研究所(2011年11月至2012年9月)。临床几乎耐受组来自华中科技大学同济医学院附属同济医院、中国人民解放军总医院、西部战区总医院、西安交通大学第一附属医院、上海长征医院、山西省第二人民医院、中国人民解放军第四七四医院(2011年12月至2012年10月)。健康对照组来自华中科技大学同济医学院附属同济医院(2011年11月至2012年11月)。所有研究对象均签署知情同意书。本研究得到华中科技大学同济医学院附属同济医院伦理委员会批准(批号：2010-1001)。
纳入标准：(1)耐受组：肾移植术后存活10年以上；全身状况良好，移植肾功能稳定；移植后少量应用免疫抑制药物，标准：泼尼松≤10 mg/d[6]；吗替麦考酚酯(MMF)≤1 g/d；硫唑嘌呤≤1 mg·kg-1·d-1；他克莫司血药浓度谷值≤5 μg/L[7]；环孢素A血药浓度谷值≤60 μg/L[8]。(2)排斥组：所有受者均进行血尿常规、肝肾功能、血电解质、肾脏彩色超声多普勒、肾穿刺活组织病理检查。经移植肾穿刺活组织病理检查，按照Banff 2007移植肾病理分级标准，证实为急、慢性排斥反应以及慢性移植肾肾病。(3)健康对照组：体检中心健康体检人群。
排除标准：近期活动性感染；合并恶性肿瘤；患有自身免疫性疾病；移植肾动脉狭窄，输尿管梗阻等肾疾病；其他重要脏器功能不全。
以肝素锂抗凝采血管取静脉血5 ml。1 800转/min离心(21℃，10 min，离心半径20 cm)。吸出上层血浆，1.8 ml冻存管分装，1 ml/管。以液氮保存运输(12～72 h)，移至-80℃冰箱保存。
取血浆10 μl加入20 μl U9裂解液(9 mol/L尿素，50 mmol/L Tris-HCl，2% 3-[3-(胆酰氨丙基)二甲铵基]丙磺酸内盐，pH 9.0)中，充分混匀。冰上静置30 min。加入370 μl CM10芯片缓冲液(50 mmol/L醋酸钠，pH 4.0)快速混匀。
以醋酸钠溶液(50 mmol/L，pH 4.0)洗脱。添加饱和白芥子酸(SPA)溶液(50%乙腈+0.5%三乙酸)，挥发后，每个芯池加入200 μl结合缓冲液，400～600转/min振荡(MS1 Minishaker)5 min，甩掉缓冲液。重复上述操作一次。
在每个芯池中加入100 μl样品，4℃400～600转/min震荡1 h，甩出样品。加入200 μl的结合缓冲液400～600转/min振荡(MS1 Minishaker)5 min，甩去液体，加结合缓冲液200 μl，再重复以上操作一次。加200 μl高效液相色谱法用水，即刻甩出。将SPA与富集的蛋白溶液混合，点于芯片上。
(1)质谱仪参数设置及外标分子量校正
MALDI(Biorad PBSⅡ)质谱仪参数设置：激光源强度：240，加速源电压：20 000 V，扫描质量范围：0～50 000 Da，信号采集次数：112次/点。应用标准肽进行外标分子量校正。
(2)生成诊断模型
采用Ciphergen ProteinChip 3.2软件输出蛋白质谱图。低分子量区间范围为1 000～50 000 Da。应用Biomarke Wizard 3.2识别蛋白质谱峰。应用Biomarker Patterns软件生成诊断模型。
应用蛋白质分析系统(ExPASy)[9]的TagIdent工具，检索SWISS-PROT及TrEMBL蛋白数据库，对差异蛋白质谱峰进行鉴定。
应用SPSS 19.0软件包进行统计学处理。正态分布的质谱峰数据进行ANOVA检验，P<0.05为差异有统计学意义，偏态分布的数据采用非参数Kruskal-Wallis H test检验，P<0.05为差异有统计学意义。
共收集符合标准的43例受试者血浆样本。三组受者在年龄、性别等一般资料的差异无统计学意义。
Protein Chip Software 3.2软件输出43例标本蛋白质谱图(图1)。横坐标为蛋白质质荷比(M/Z)，纵坐标为蛋白质丰度(Intensity)。
Biomarker Wizard软件获取可识别的差异蛋白质谱峰152个。M/Z值在1 000～5 000范围内有94个，5 000～10 000有33个，10 000～50 000有25个。经ANOVA检验，P<0.05共有21个，P<0.01有11个(表1)。
可识别血浆差异蛋白质谱峰
可识别血浆差异蛋白质谱峰
| 质谱峰 | 离均差平方和 | 均方差 | F值 | P值 |
|---|---|---|---|---|
| M1 077.36 | 47.535 | 23.768 | 4.839 | 0.013 |
| M1 103.27 | 81.194 | 40.597 | 3.531 | 0.039 |
| M1 187.55 | 844.045 | 422.023 | 6.729 | 0.003 |
| M1 195.85 | 1 360.902 | 680.451 | 5.927 | 0.006 |
| M1 207.48 | 598.817 | 299.409 | 7.409 | 0.002 |
| M1 266.43 | 86.857 | 43.429 | 6.007 | 0.005 |
| M1 576.00 | 268.173 | 134.086 | 4.407 | 0.019 |
| M1 716.69 | 8.441 | 4.220 | 4.220 | 0.022 |
| M1 795.36 | 112.346 | 56.173 | 6.042 | 0.005 |
| M1 814.32 | 138.897 | 69.449 | 5.460 | 0.008 |
| M1 966.28 | 12.838 | 6.419 | 4.479 | 0.018 |
| M2 373.07 | 60.927 | 30.464 | 5.544 | 0.007 |
| M2 412.18 | 58.729 | 29.364 | 6.608 | 0.003 |
| M2 565.15 | 111.224 | 55.612 | 8.974 | 0.001 |
| M2 662.71 | 1 532.715 | 766.357 | 3.963 | 0.027 |
| M2 863.49 | 51.508 | 25.754 | 3.289 | 0.048 |
| M2 986.93 | 41.663 | 20.831 | 5.655 | 0.007 |
| M4 016.64 | 31.027 | 15.513 | 5.292 | 0.009 |
| M6 674.78 | 64.105 | 32.052 | 3.773 | 0.032 |
| M7 031.79 | 47.223 | 23.611 | 4.683 | 0.015 |
| M11 354.6 | 6.583 | 3.291 | 3.570 | 0.037 |
诊断模型是由6个节点(Node1～6)和7个终末节点(Terminal Node1)形成的树状图(图2)。Node 6与Node 2为同一蛋白质谱峰1 966.28。诊断模型对43例样本的分组结果如图2所示。
各节点的蛋白质平均谱峰强度(丰度)在健康、耐受、排斥三组间的比较。
该模型对耐受组、排斥组、健康组准确率分别为84.6%、83.3%、91.7%(表2)。计算每组指标前将另外两组样本合并，分别计算各评价指标。耐受、排斥、及健康组的曲线下面积(ROC)分别为0.951、0.989及0.944。
主语诊断模型的评价结果(%)
主语诊断模型的评价结果(%)
| 组别 | 例数(例) | 敏感性 | 特异性 | 误诊率 | 漏诊率 |
|---|---|---|---|---|---|
| 健康组 | 13 | 83.3 | 92.0 | 8.0 | 16.7 |
| 耐受组 | 18 | 91.7 | 96.8 | 3.2 | 8.3 |
| 排斥组 | 7 | 84.6 | 90.0 | 10.0 | 15.4 |
B型利钠肽(ANFB，M2 565.15)，黑色素浓集激素(MCH，M1 966.28)，三叶因子1(TFF1，M6 674.78)，强啡肽原(PDYN，M1 103.27)，蛋白酶体激活亚3(PSME3，M1 716.69)。
目前，临床几乎耐受仍缺少有效的预测及诊断方法。目前应用的诊断方法存在有创、指标单一以及操作复杂、费用昂贵等问题[10,11]。SELDI-TOF-MS技术整合了芯片和质谱技术，能够大规模获取生物样本中的蛋白质信息，具有快速、高效、方便等优势。
本研究结果显示血浆中低分子量蛋白质与肾移植临床几乎耐受相关性较大，可作为筛选生物标记物的重要选择范围。
血浆中缺乏可以有效诊断临床几乎耐受的单一生物标记物。这反映出应用蛋白质组学技术筛选生物标记物并建立诊断模型的技术优势及必要性。诊断模型由五个节点构成。根节点Node 1在三组样本间差异均有统计学意义，分组作用最为显著。Node 2、Node 3在健康组峰值较低，而在其余两组较高。此类蛋白质在有统计学差异的质谱峰中数量最多，占52.4%。表明肾移植及移植后处理引起的较多血浆蛋白含量升高。Node 4在健康组峰值较高，而在其余两组含量较低提示移植导致了该蛋白质血浆含量下降。Node 5易于将排斥组病例区分出来，但健康组和耐受组含量相近。研究此类蛋白质的生物机制对于探索免疫耐受具有重要意义。
每组内各节点蛋白质的平均峰强度按Node1至Node 6顺序排列时，形成各组特征性的图形，即蛋白质"指纹"特征。"
"为健康组"指纹"，"
"为耐受组"指纹"，"
"为排斥组"指纹"。这些指纹特征可用于区分及鉴别各组病例，也可以对几乎耐受进行诊断和预测。
模型诊断临床几乎耐受及排斥反应均具有较高的敏感性和特异性，对于区分耐受组与排斥组正确率可达100%。
通过对模型节点质谱峰的生物学鉴定，获得质谱峰的蛋白质名称。ANFB具有促进排钠、利尿等生理功能。已作为早期诊断移植肾急性排斥反应的敏感指标[12,13]。MCH是一种神经肽，主要存在于下丘脑侧外侧区，是调节能量代谢的关键调节因子，在免疫调节中也发挥重要作用[14]。TFF1主要在胃肠杯状细胞中表达，具有黏膜保护、修复作用，与细胞迁移、增殖、分化密切相关[15]。PDYN是强啡肽前体，而强啡肽在应激、免疫调控的机制中起着重要的作用[16]。PSME3主要位于细胞核，参与免疫功能的调控[17]。PSME3在耐受组血浆含量最高并与排斥组间差异明显，可作为识别几乎耐受者的良好指标进行进一步研究。上述节点蛋白质广泛参与免疫、炎症反应以及肿瘤发生等生物机制，但在肾移植领域的研究还非常有限，是进一步探索的良好靶点。这些血浆蛋白在临床中作为肾移植几乎耐受的预警及诊断指标也有重要应用价值。
本研究中排斥组受者存在不同程度的肾损伤，而几乎耐受者肾功能良好，筛选出的标记物中存在反应肾损伤及肾功不全的蛋白质，后续研究需要对节点蛋白的生物机制进行进一步探讨。由于几乎耐受者数量较少，本研究是小样本筛查，还需要扩大样本量进行前瞻性研究。
所有作者均声明不存在利益冲突
