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微小RNA (miRNA,miR)是一类由17~27个核苷酸构成的RNA分子,在转录后水平调节基因表达[1]。信号转导转录活化因子3(STAT3)在多种肿瘤中有促进细胞增殖、侵袭和抗凋亡作用,且有研究报道STAT3能抑制miR-146b-5p表达[2],本研究旨在探讨miR-146b-5p对STAT3的作用。
用过表达miR-146b-5p和空载体对照病毒(上海吉玛公司)分别转染U251和A172细胞(中国科学院上海细胞库)后分为3组:过表达miR-146b-5p的实验组、转染空载体的阴性对照组和未转染的空白对照组。
用定量聚合酶链反应(qPCR)检测胶质瘤细胞与正常人星形胶质细胞(Sciencell公司)中miR-146b-5p表达差异;克隆形成实验和细胞计数试剂盒(CCK-8)实验比较实验组与对照组细胞增殖能力;以Transwell小室(Corning公司)侵袭实验比较实验组与对照组细胞侵袭能力;双染凋亡检测试剂盒比较实验组与对照组细胞早期凋亡比例。Western blot比较实验组与对照组细胞磷酸化STAT3(pSTAT3)的表达水平。
应用SPSS 18.0软件分析,采用t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。
qPCR结果示miR-146b-5p在胶质瘤细胞中的表达水平低于正常人星形胶质细胞(P<0.05)。过表达病毒和阴性对照病毒转染U251、A172细胞后,实验组miR-146b-5p表达水平高于空载体组和空白组12~30倍(P<0.05)。
实验组细胞克隆形成率和生长速度,明显低于空载体组和空白组,U251、A172细胞中3组克隆数分别为(9±3)、(36±6)、(39±10)个;(34±8)、(75±12)、(84±9)个。CCK-8生长曲线示在2 d时,实验组细胞生长速度开始低于对照组,第4~5天差异最大。结果提示上调miR-146b-5p可抑制胶质瘤细胞增殖和生长。
Transwell小室侵袭实验的结果显示实验组细胞的侵袭能力明显低于空载体组和空白组。U251、A172三组侵袭细胞数分别为:(112±18)、(232±13)、(244±32)个;(121±10)、(228±21)、(237±42)个(P<0.05)。
凋亡实验结果显示实验组早期凋亡细胞比例显著高于对照组,U251、A172三组细胞早期凋亡比例分别为18.26%、6.26%、5.99%;15.08%、4.30%、4.28%。结果提示miR-146b-5p过表达能促进胶质瘤细胞凋亡。
Western blot结果显示上调miR-146b-5p能抑制胶质瘤细胞pSTAT3的表达。U251、A172三组细胞pSTAT3蛋白相对灰度值分别为0.22±0.03、0.48±0.06、0.46±0.02;0.18±0.01、0.37±0.03、0.39±0.05。
本研究结果显示,miR-146b-5p低表达是胶质瘤的普遍特征,对其上调能降低胶质瘤的增殖、侵袭能力且促进凋亡,这与其在其他肿瘤中的作用一致[3],提示miR-146b-5p下调可能在胶质瘤发生发展进程中发挥重要作用。
miR-146b-5p发挥抑制胶质瘤增殖、侵袭和促进凋亡作用的过程中,pSTAT3可能是关键点。我们用Western blot法比较了过表达miR-146b-5p前后,胶质瘤细胞pSTAT3的蛋白水平,发现两者呈负相关,说明miR-146b-5p可抑制pSTAT3的表达。
然而,miR-146b-5p如何产生上述抑瘤效应,如何抑制pSTAT3表达,以及两者之间是否有必然联系,尚需进一步研究。