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非肌肉肌球蛋白ⅡA(NMⅡA、MYH9)由两条重链、两条调节轻链和两条必需轻链组成。MYH9参与血栓性疾病、遗传性疾病等多种疾病的发生发展[1]。本研究旨在探讨其在大肠癌组织中的表达及其临床意义。
选择30例采取手术治疗的TNM Ⅲ期大肠癌患者，取其术中切除的大肠癌组织及癌旁组织(距癌组织>10 cm)标本。
(1)提取组织样品总蛋白，用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。(2)将总蛋白样品融化至室温，加入50 mmol/L碳酸氢氨将其溶解；加入1 mol/L的二硫基苏糖醇(DTT)，调定至终质量浓度为20 mmol/L；56 ℃，避光1 h；温度降至室温后加入等量的1 mol/L的碘代乙酰胺，混匀后调定至终质量浓度为50 mmol/L；避光45 min；加入胰酶，37 ℃过夜；将酶切产物真空抽干，－80 ℃保存。(3)利用二维色谱分离样品；LTQXL离子肼质谱仪检测二维色谱洗脱的多肽，再进行数据库检索，鉴定出相关多肽和蛋白质。
取30例大肠癌组织及配对的癌旁组织样本，测定蛋白质含量；进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳；转膜；封闭，4 ℃过夜；磷酸盐吐温缓冲液(PBST)清洗后加入MYH9兔抗人单克隆抗体(1:200倍稀释)，反应2 h；PBST清洗后加入山羊抗兔IgG，反应1 h；PBST洗5次；增强型化学发光试剂(ECL)显影。扫描记录结果。
取大肠癌组织切片，二甲苯脱蜡；水化；柠檬酸钠抗原修复；3%H2O2室温孵育；5%兔血清封闭；加MYH9兔抗人单克隆抗体、山羊抗兔IgG、S-A/辣根过氧化物酶(HRP)；二氨基联苯胺(DAB)显色；苏木素复染；0.1%盐酸分化；梯度乙醇逐级脱水；二甲苯透明；中性树脂封片。显微镜下观察并拍照。
本研究通过谱图数来评价蛋白质的丰度，再通过丰度变化来界定差异蛋白。差异蛋白的界定标准为：(1)大肠癌组织与癌旁组织中蛋白质的谱图数的比值≥1；(2)谱图数的差值≥72。每个样品重复测试3次。本试验共鉴定出差异表达的蛋白质35个，目标蛋白MYH9在大肠癌组织中的表达量高于癌旁组织。
30组标本中癌组织中MYH9的表达量高于癌旁组织的共23组；低于癌旁组织的共7组。经软件扫描及秩和检验分析，两者比较差异有统计学意义。
免疫组织化学阳性结果的判定标准为：细胞内出现清晰的棕褐色或棕黄色颗粒。
