探讨印度刺猬蛋白(Ihh)在软骨细胞异常钙化退变的作用及其机制。
取刚出生6 d的C57小鼠，提取肋软骨细胞，利用苏木精-伊红(HE)染色、番红O固绿染色和Ⅱ型胶原免疫组织化学进行软骨细胞表型鉴定。实验分为Ihh高表达组，加入Ihh重组蛋白5 mg/L；Ihh信号通路抑制组，加入环耙明20 μmol/L；空白对照组，加入磷酸盐缓冲液(PBS)。实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测Ⅱ型胶原(COLⅡ)、X型胶原(COLX)、Runt相关转录因子2(Runx2)、骨钙素(OCN)、碱性磷酸酶(ALP)、蛋白多糖(AGG)、多通跨膜蛋白(ANKH)、核苷酸焦磷酸酶1(ENPP1)等因子的mRNA表达水平。利用流式细胞仪检测抑制Ihh信号通路后对软骨细胞凋亡的影响。
Ihh高表达组与空白对照组相比ALP(3.450±1.357比1.223±0.740)、OCN(2.410±0.395比1.093±0.453)、Runx2(3.057±1.477比1.144±0.574)、COLX(3.804±1.400比1.116±0.511)表达增加，ANKH(0.255±0.042比1.101±0.471)、AGG(0.574±0.355比1.007±0.126)、COLⅡ(0.670±0.065比1.027±0.236)、ENPP1(0.354±0.058比1.091±0.446)表达降低，差异有统计学意义(P<0.05)，Ihh信号通路抑制组与空白对照组相比ANKH(5.345±1.341比1.101±0.471)，ENPP1(4.289±0.978比1.091±0.446)、COLⅡ(2.141±0.685比1.027±0.236)、AGG(2.892±0.761比1.007±0.126)表达增加，COLX(0.501±0.164比1.116±0.511)、Runx2(0.243±0.081比1.144±0.574)、OCN(0.326±0.077比1.093±0.453)、ALP(0.329±0.190比1.223±0.740)表达降低，差异有统计学意义(P<0.05)。流式结果显示抑制Ihh信号通路能引起软骨细胞凋亡(t＝9.412，P<0.05)。
Ihh可以通过上调COLX、Runx2、OCN及ALP，抑制ANKH、ENPP1、AGG及COLⅡ基因的表达，进一步促进软骨细胞的异常钙化退变。
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研究表明在小鼠椎间盘组织中可以检测到印度刺猬蛋白(Ihh)，且在退变腰椎间盘组织中Ihh表达增加。同时，退变腰椎间盘组织中碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OCN)等钙化指标明显增加[1]，但Ihh在椎间盘组织异常钙化退变中的作用尚不清楚。本实验采用小鼠肋软骨细胞代替终板软骨细胞，探讨Ihh在软骨细胞异常钙化退变中的作用。
