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在神经系统中，微小RNA(miRNA，miR)参与细胞生长、增殖、分化、迁移、凋亡以及神经轴突再生[1]。本实验旨在探讨腺病毒介导miR-133及miR-30C体外转染对大鼠坐骨神经雪旺细胞(SC)的影响及其意义。
采用AdMaxTM包装系统，构建Ad穿梭质粒Ad5-miR-133/30C-增强绿色荧光蛋白(EGFP)，同时构建阴性对照载体Ad5-LacZ。连接扩增产物经过转化培育获得单克隆，对单克隆进行酶切反应及聚合酶链反应(PCR)检测，并对表达载体进行测序鉴定，以验证获得正确的阳性克隆。
取大鼠双侧坐骨神经(雄性3月龄SD大鼠，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供，合格证号为SYXK(鄂)2016-0057)。体外培养坐骨神经SC，实验分组：A组为转染空白腺病毒质粒的SC；B组为转染Ad5-miR-133-EGFP质粒的SC；C组为转染Ad5-miR-30C-EGFP质粒的SC。封闭、孵育、复染、封片、切片于荧光显微镜下观察并采集图像。本研究通过武汉市第四医院医学伦理委员会审批，伦理批号为KY2018-019-01。
将对数生长的SC接种于24孔培养板，A组加入阴性对照载体Ad5-LacZ质粒，B组加入病毒Ad5-miR-133-EGFP质粒，C组加入病毒Ad5-miR-30C-EGFP质粒；在病毒转染后的6、24、48 h提取上清液，应用PCR检测各组miR-133/30C、CTGF、COL-Ⅰ的表达，进行统计学处理。
按照6、24、48 h组顺序依次上样，取样本组织匀浆后提取蛋白，经上样、转膜、封闭后，依次加入兔抗鼠多克隆抗体，暴光显色。用Quantity One 4.4软件分析计算出CTGF、COL-Ⅰ蛋白吸光度(A)值与β肌动蛋白(β-actin)A值的比值，反映CTGF、COL-Ⅰ蛋白水平。
应用SPSS 19.0统计软件分析，两样本均数之间的比较用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
培养细胞传代纯化后，SC纯度可以提高到90%以上。重组质粒Ad5-miR-133/30C-EGFP经XhoⅠ与EcoR Ⅴ双酶切获得酶切产物，将其进行琼脂糖凝胶电泳，在21 bp和89 bp左右见DNA条带，与预计的长度一致，表明成功将目的基因miR-133/30C克隆到穿梭质粒Ad5载体上。
3组SC在6、24、48 h均阳性表达CTGF及COL-Ⅰ。与A组比较，B组和C组雪旺细胞在6、24、48 h荧关强度明显降低(12.56±3.24、10.48±2.75、11.42±2.87；13.54±3.16、14.08±2.29、15.13±2.25；t＝2.219，P<0.05)，两组之间差异有统计学意义。以A组作为参考，B组miR-133含量明显升高，CTGF mRNA表达明显降低，COL-Ⅰ mRNA表达也随之下降，两组数据差异有统计学意义(20.26±2.35、19.84±1.41、21.17±3.75；26.19±3.35、23.13±2.45、22.09±4.07，t＝2.113，P<0.05)；C组miRNA-30C含量明显升高，CTGF mRNA表达明显降低，COL-ⅠmRNA表达也随之下降，两组数据差异有统计学意义(t＝2.052，P<0.05)。与A组比较，B组和C组CTGF及COL-Ⅰ蛋白含量明显降低，两组数据差异有统计学意义(t＝2.147，P<0.05)。
SC是周围神经纤维的鞘细胞，其对周围神经的再生起到重要作用。本研究在体外大鼠SC模型上，通过基因转染方式发现外源性miR-133和miR-30C可明显下调CTGF的表达，降低SC分泌胶原蛋白，对损伤神经的纤维化病变有一定的抑制作用。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
