钟玉葵; 邓丽丝; 邓秋连; 钟华敏; 骆明勇; 周珍文; 颜慕霞; 谢永强

doi:10.3760/cma.j.issn.1008-1372.2018.06.007

点赞 0
分享 0
收藏 0
纠错

• 论著 •

利用环介导等温扩增技术快速检测肠出血性大肠杆菌及其毒素的方法建立和评价

中国医师杂志, 2018,20(6) : 826-831. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1008-1372.2018.06.007

摘要

目的

针对编码大肠杆菌志贺毒素由位于STEC染色体上的前噬菌体携带的stx基因和O₁₅₇抗原编码基因rfbe设计特异性引物，并对反应体系和反应条件进行优化，建立一种针对肠出血性大肠杆菌及其毒素的环介导等温扩增(LAMP)反应技术检测法。

方法

通过优化LAMP反应的各影响因素，确定LAMP反应体系和反应条件并利用已优化的LAMP体系进行相关检测。

结果

确定LAMP反应体系为：内引物(FIP、BIP)与外引物(F3、B3)的比例为8∶1，Mg^2＋浓度10 mmol/L，dNTPs浓度1.2 mmol/L，甜菜碱浓度0.4 mol/L，Bst DNA聚合酶的添加量为1 μl。LAMP反应时间为60 min，反应温度为60 ℃。以PCR法作为对照，LAMP检测的敏感度为5×10¹ CFU/mL，PCR的敏感度为5×10⁴ CFU/mL。同时，研究应用所建立的LAMP快速检测法对部分革兰阳性和阴性菌及102株O₁₅₇大肠杆菌进行快速检测。结果显示，检测特异度达100%，O₁₅₇大肠杆菌rfbe检出率为100%(102/102)，stx1检出率为95.2%(59/62)，stx2检出率为92.9%(52/56)。

结论

成功建立了一种可应用于肠出血性大肠杆菌及其毒素的敏感、特异的LAMP检测方法。

引用本文: 钟玉葵, 邓丽丝, 邓秋连, 等. 利用环介导等温扩增技术快速检测肠出血性大肠杆菌及其毒素的方法建立和评价 [J] . 中国医师杂志, 2018, 20(6) : 826-831. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1008-1372.2018.06.007.

参考文献导出: Endnote NoteExpress RefWorks NoteFirst 医学文献王

扫描看全文

正文

作者信息

基金 0 关键词 0

English Abstract

阅读 0 评论 0

相关资源

引用 | 论文 | 视频

版权归中华医学会所有。

未经授权，不得转载、摘编本刊文章，不得使用本刊的版式设计。

除非特别声明，本刊刊出的所有文章不代表中华医学会和本刊编委会的观点。

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)反应技术自有文献报道^[1,2,3]以来，因其成本低、特异度强、敏感度高、方便快捷等特点，目前已经成为常用的临床现场检验方法之一^[4]。LAMP法为常见致病菌的快速检测提供了新的发展方向，更利于一些基层医疗单位和检验检疫等机构的应用。笔者针对编码大肠杆菌志贺毒素由位于STEC染色体上的前噬菌体携带的stx基因和O₁₅₇抗原编码基因rfbe设计特异性引物，并对反应体系和反应条件进行优化，建立一种针对肠出血性大肠杆菌及其毒素的LAMP检测法。方法的成功建立有望成为基层医疗单位的简易常规检测手段，对于提高基层医疗单位的临床检验技术、缩短检验时间等方面具有重要意义。

贡献者信息

钟玉葵

510120　广州市妇女儿童医疗中心检验科

邓丽丝

510800　广州市花都区人民医院急诊科

邓秋连

510120　广州市妇女儿童医疗中心检验科

钟华敏

510120　广州市妇女儿童医疗中心检验科

骆明勇

511400　广州，广东省妇幼保健院医学遗传中心

周珍文

510120　广州市妇女儿童医疗中心检验科

颜慕霞

510120　广州市妇女儿童医疗中心检验科

谢永强

510120　广州市妇女儿童医疗中心检验科

通信作者

邓秋连

510120　广州市妇女儿童医疗中心检验科

Email：q138@163.com

关键词

肠出血性大肠杆菌/微生物学; 核酸扩增技术; 志贺毒素/遗传学; 细菌蛋白质类/遗传学;

基金项目

广东省省级科技计划项目（2015A030401007）

历史

出版日期：2018-06-20

收稿日期：2017-07-04

本文编辑

谢意桃

Original Article

Development and evaluation of loop-mediated isothermal amplification assay for the rapid detection of Escherichia coli and its microbial toxin

Yukui Zhong, Lisi Deng, Qiulian Deng, Huamin Zhong, Mingyong Luo, Zhenwen Zhou, Muxia Yan, Yongqiang Xie

Published 2018-06-20

Cite as J Chin Physician, 2018, 20(6): 826-831. DOI: 10.3760/cma.j.issn.1008-1372.2018.06.007

Abstract

Objective

To establish and optimize a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method for the rapid detection of Escherichia coli and its microbial toxin.

Methods

The LAMP reaction system and reaction conditions were determined by optimizing LAMP reaction, and the optimized LAMP system was used for the detection.

Results

Primers targeting shiga toxin (stx) gene and O₁₅₇ antigen gene rfbe were designed. The established and optimized LAMP amplification system contained 1.2 mmol/L dNTPs, 10 mmol/L MgSO₄, 0.4 mol/L betaine, 1 μl 10×Bst DNA polymerase Buffer, 8 U Bst DNA polymerase fragment, 2 μl DNA template, and the ratio of inner-primer (FIP and BIP) and outer-primer (F3 and B3) were 8∶1. Time and temperature for LAMP was 60 min, 60 ℃. The sensitivity was 10³ times higher than polymerase chain reaction (PCR), reached 5×10¹ CFU/ml. When LAMP was applied to 19 reference strains, 102 EHEC strains, the specification was 100% while identification rate of rfbe, stx1 and stx2 gene reached 100%, 95.2%, 92.9%.

Conclusions

The LAMP method showed a promising prospect for the rapid detection of common nosocomial pathogens microbial toxin.

Key words:

Enterohemorrhagic escherichia coli/MI; Nucleic acid amplification techniques; Shiga toxin/GE; Bacterial proteins/GE

Contributor Information

Yukui Zhong