分析人富血小板血浆(PRP)调控人表皮干细胞(ESC)的靶基因。
(1)收集陆军军医大学第一附属医院行泌尿外科手术的6例男性患者术后弃用的包皮组织，患者年龄为5～25岁，既往身体健康，无泌尿系统感染，采用快速贴壁法培养人ESC并进行形态学观察及鉴定。收集解放军南部战区总医院1名29岁女性健康志愿者静脉血40 mL，采用二次离心法提取PRP。(2)将培养成功的原代人ESC按照随机数字表法分为对照组和PRP处理组，每组3孔。对照组细胞不行特殊处理；PRP处理组待细胞贴壁12 h，在培养基中加入PRP，使其最终体积分数为2.5%。提取RNA应用RNA测序技术进行2组人ESC转录组测序和数据分析，以错误发现率<0.05、差异倍数≥4为标准应用Dr. Tom数据挖掘系统筛选差异表达基因，对获得的差异表达基因进行基因本体论(GO)富集分析找出显著富集的GO条目。再用京都基因和基因组(KEGG)信号通路注释分析进一步寻找差异表达基因可能参与的生物学过程或者代谢通路。最后，选取与再上皮化过程相关且差异表达明显的基因，利用实时荧光定量反转录PCR验证基因的差异表达情况。对数据行独立样本t检验。
(1)培养细胞呈克隆样生长，形态为铺路石样，CD49f阳性率达95.132%、CD71阳性率为0.006%，证明ESC原代培养成功。(2)质控数据分析显示，选取样本质量较好，序列比对百分比较高，满足测序要求。(3)测序数据显示，2组间共有449个差异表达基因，其中上调基因354个、下调基因95个，进一步聚类分析确定2组间有18个显著上调基因和5个显著下调基因。GO富集分析以及KEGG信号通路注释分析表明，显著差异表达基因主要富集在表皮构建和角化过程，同时可能与白细胞介素17信号通路相关。(4)选取了与再上皮化过程相关且差异表达明显的角蛋白19、角蛋白10以及S100A7基因进行验证。实时荧光定量反转录PCR显示，与对照组比较，PRP处理组细胞角蛋白19 mRNA和S100A7 mRNA表达量明显升高(t＝10.270、5.690，P<0.01)，角蛋白10 mRNA表达量明显降低(t＝7.306，P<0.01)，与测序数据结果一致。
PRP调节人ESC功能促进创面再上皮化涉及角蛋白19、角蛋白10以及S100A7等多个基因的转录调控，深入探讨PRP影响人ESC的可能调控网络将为其后续临床治疗提供依据。
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当今社会人口老龄化日益严重，慢性创面疾病患病率连年上升，其迁延不愈、反复发作的特点严重影响患者的日常生活及身心健康，逐渐成为全球范围内的公共健康问题[1]。再上皮化是创面愈合的重要环节，表皮及时覆盖可以有效控制创面蔓延、加速愈合。
近年来，富血小板血浆(PRP)凭借其无免疫原性、来源安全、制备简单等优点，以及富集的生长因子[2]和显著的修复效果，被广泛应用于骨科[3]、口腔颌面外科[4]、整形外科[5]、康复科[6]等多学科的创伤修复治疗。越来越多的研究证实，PRP具有促进创面愈合的功能，其通过影响新生上皮长度及厚度参与再上皮化过程，提高创面愈合质量。然而，关于PRP如何调控再上皮化的机制研究尚不完善。再上皮化过程涉及多种皮肤细胞，其中表皮干细胞(ESC)是关键的效应细胞[7]。ESC主要分布于表皮基底层、毛囊隆突部及皮脂腺内[8]。研究表明，ESC在维持表皮稳态以及创面修复中扮演着重要角色[9,10]，它可在刺激信号的调控下再分布，通过分裂增殖和迁移分化的方式促进再上皮化[11]。然而，PRP与ESC生物学功能的调控关系尚未明确，PRP是否通过影响ESC发挥其促再上皮化的作用值得深入探讨。目前，高通量测序已成为一项被业内认可的技术，其中RNA测序(RNA-seq)是重要的转录组分析方法，被认为是转录组研究中具有划时代意义的技术，并广泛应用于基因表达水平分析等领域[12]。因此，本研究基于前期研究和已有报道，利用RNA-seq分析技术，初步探讨了PRP可能影响人ESC功能的靶基因，以期揭示PRP通过促进再上皮化，影响创面愈合的转录调控机制，为PRP促进创面修复与再生机制的深入研究及将其广泛应用于临床慢性创面治疗奠定基础。
人包皮组织为陆军军医大学第一附属医院6例男性患者行泌尿外科手术后的弃用组织(患者知情同意)，年龄为5～25岁，既往身体健康，无泌尿系统感染。静脉血样来源于解放军南部战区总医院1名女性健康志愿者，年龄为29岁。
KC无血清培养基(K-SFM)、胎牛血清、高糖DMEM培养基购自美国Gibco公司，eFluor 450标记的兔抗小鼠CD49f单克隆抗体和异硫氰酸荧光素标记的兔抗小鼠CD71单克隆抗体均购自美国BD公司，TRIzol试剂购自美国Sigma公司，RNA反转录试剂盒及实时荧光定量PCR试剂盒购自日本Takara公司。二氧化碳孵箱购自美国Thermo Fisher Scientific公司，光学显微镜购自日本Olympus公司，Quantagene q255型荧光定量PCR仪购自北京诺禾致源科技股份有限公司。
取人包皮组织，采用快速贴壁法培养ESC。采用体积分数75%乙醇浸泡消毒，置于细胞培养超净台，在无菌环境下去除皮下脂肪组织，采用PBS冲洗3～5遍，修剪为大小0.5 cm×0.5 cm的皮片，平铺于培养皿后加入适量的100 g/L中性蛋白酶，以刚好覆盖皮片为准，4 ℃消化过夜。去除上清液，分离真皮、表皮后将表皮组织剪碎，加入含乙二胺四乙酸的25 g/L胰蛋白酶37 ℃消化10 min，其间摇匀1次。加入含体积分数10%胎牛血清的高糖DMEM培养基终止消化，重新悬浮细胞后200目筛网过滤。过滤液于室温下离心半径10 cm，1 000 r/min离心5 min后弃去上清液，收集细胞，采用K-SFM重新悬浮后接种于预先包被过Ⅳ型胶原的培养皿中，置于37 ℃体积分数5%二氧化碳孵箱孵育15 min，细胞贴壁后去除上清液及杂质，再次加入K-SFM，置于37 ℃体积分数5%二氧化碳孵箱中培养，每隔2天换液1次，期间于100倍光学显微镜下观察细胞形态变化。细胞形态呈现铺路石样改变，加入eFluor 450标记的兔抗小鼠CD49f单克隆抗体(稀释比为1∶200)和异硫氰酸荧光素标记的兔抗小鼠CD71单克隆抗体(稀释比为1∶200)，采用流式细胞仪检测，CD49f阳性率≥90%，CD71不表达或极少量表达则提示ESC培养成功。
采用二次离心法提取PRP。收集健康志愿者静脉血40 mL，室温下160×g离心10 min，吸取上层血浆和中间的白膜层置于无菌的离心管中，再于室温下离心半径10 cm，3 000 r/min离心20 min，上层2/3为乏血小板血浆，下层1/3为实验所需PRP，提取PRP置于-80 ℃超低温冰箱保存。
将培养成功的原代人ESC以2×106个/mL的密度接种于6孔板中，按照随机数字表法分为PRP处理组和对照组，每组3孔。对照组细胞不行特殊处理；PRP处理组待细胞贴壁12 h，在K-SFM中加入PRP，使其最终体积分数为2.5%。培养96 h后收集2组细胞分装于1.5 mL EP管中，加入1 mL TRIzol，室温静置5 min，使核蛋白充分解离提取RNA，置于-80 ℃超低温冰箱保存。
将2组ESC RNA样品送武汉华大基因科技有限公司进行转录组测序和数据分析，其中采用转录拼接对齐分层索引HISAT将过滤后的测序序列与参考基因组序列比对。数据挖掘和图形展示过程均由Dr.Tom数据挖掘系统结合不同的已发布软件完成。Dr.Tom数据挖掘系统所包含的软件(小工具)和常规转录组分析一样，均具有参考文献。
利用Dr.Tom分析基因在PRP处理组和对照组中的差异表达情况。差异表达基因的筛选标准是错误发现率<0.05，差异倍数≥4。
对获得的显著差异表达基因进行基因本体论(GO)富集分析以及京都基因和基因组(KEGG)信号通路的注释分析。基于Dr.Tom数据挖掘系统，寻找差异表达基因显著富集的GO条目，随后通过KEGG信号通路注释分析进一步寻找差异表达基因可能参与的生物学过程或者代谢通路。
选取与再上皮化过程相关且差异表达明显的基因，利用实时荧光定量RT-PCR对基因的差异表达情况进行验证。角蛋白19上游引物为5′-ATATGAGGTCATGGCCGAGC-3′，下游引物为5′-TCCGTTTCTGCCAGTGTGTC-3′，产物大小为219 bp；角蛋白10上游引物为5′-GCCTGGTTCAATGAAAAGAGCA-3′，下游引物为5′-GCACACAGTAGCGACCTTCT-3′，产物大小为196 bp；S100A7上游引物为5′-ACACCAGACGTGATGACAAGA-3′，下游引物为5′-AAGACATCGGCGAGGTAATTTGT-3′，产物大小为118 bp；GAPDH上游引物为5′-GGTCGGAGTCAACGGATTTG-3′，下游引物为5′-TGGGTGGAATCATATTGGAAC-3′，产物大小为101 bp。PCR条件：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性40 s，62 ℃退火40 s和72 ℃延伸1 min，共40个循环。以GAPDH为内参，采用Δ循环阈值(Ct)法计算目的基因的相对表达量，即2-ΔΔCt，本实验重复3次。
采用GrapPad Prism 7 XML统计软件分析，计量资料数据均符合正态分布，以
±s表示，行独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
培养7 d，光学显微镜下观察到，原代分离的细胞呈克隆样生长，细胞形态为铺路石样(图1)。培养7 d，流式细胞仪检测结果显示，CD49f阳性率达95.132%，而CD71的阳性率仅0.006%(图2)，证明ESC原代培养成功。
注：R6表示CD71单阳性细胞，R7表示CD71与CD49f双阳性细胞，R8表示CD71与CD49f双阴性细胞，R9表示CD49f单阳性细胞
本研究送检PRP处理组和对照组各3个样本，PRP处理组3个样品名分别为P961、P962、P963，对照组3个样品名分别为C961、C962、C963。使用桌面型高通量基因测序仪BGISEQ-500平台对6个样本进行检测，每个样品平均产出6.87 Gb数据。样品比对基因组的平均比对率为94.27%，比对基因集的平均比对率为68.00%，一共检测到17 312个基因。2组组内基因的相关系数均较高，组间的相关系数则相对较低，说明组内的基因表达水平相似性高、差异小，样本质量较好。
原始测序数据包含低质量、接头污染以及未知碱基N含量过高的测序序列，数据分析之前需要去除它们以保证结果的可靠性。过滤后的测序数据显示，PRP处理组共计20.63 Gb，对照组共计20.57 Gb。2组各样本的碱基正确识别率相近，均超过96%。测序质量满足后续分析要求。见表1。
2组人表皮干细胞数据的产出质量
2组人表皮干细胞数据的产出质量
| 组别及样本 | 原始测序数据(Gb) | 过滤后的测序数据(Gb) | 碱基正确识别率(%) | |
|---|---|---|---|---|
| 对照组 | ||||
| C961 | 49.08 | 6.87 | 96.36 | |
| C962 | 49.08 | 6.88 | 96.48 | |
| C963 | 49.08 | 6.82 | 96.41 | |
| 富血小板血浆处理组 | ||||
| P961 | 49.08 | 6.83 | 96.30 | |
| P962 | 49.08 | 6.82 | 96.41 | |
| P963 | 50.83 | 6.98 | 96.26 | |
2组测序序列与参考基因组序列比对百分比均高于70%，对照组3个样本C961、C962、C963的比对百分比分别为94.37%、94.39%、94.03%，PRP处理组3个样本P961、P962、P963的比对百分比分别为94.61%、94.30%、93.93%，表明参考基因组序列选择合适。
与对照组比较，PRP处理组差异表达基因总共有449个，其中上调基因354个、下调基因95个。进一步对449个差异表达基因进行聚类分析，筛选出显著差异的23个基因，包括18个显著上调基因、5个显著下调基因。见图3。
注：1.对照组，2.富血小板血浆处理组；红色表示表达相对较高，蓝色表示表达相对较低；a～w.代表23个显著差异表达基因，依次为CXC趋化因子配体14、角蛋白6C、LOC112267876、MT1E、角蛋白10、角蛋白7、角蛋白19、ALDH1A3、ADIRF、KLK7、CLDN4、IVL、GPRC5A、S100A4、NDRG2、SPRR3、S100P、脂质运载蛋白2、PI3、角蛋白13、S100A7、SAA2、SPRR2A
基于GO功能分类，对显著差异表达的23个基因在生物学过程、细胞组件和分子功能中的富集情况进一步分析显示：显著下调基因主要富集在中间丝结构，参与表皮发育正性调控以及角化过程，同时影响了结构分子活性和表皮结构组成。显著上调基因主要富集在胞外外泌体和角质套膜，参与角化过程，同时影响了结构分子活性。GO富集结果主要表现为对表皮构建和角化过程的调节，参与该过程的主要有10个基因。见图4、表2。
注：黄色线条表示富集条目下基因的数目；蓝色条带表示-log10（Q值），是对Q值进行的对数转化，转化后数值越大代表差异越显著
2组人表皮干细胞基因本体论富集分析的主要差异表达基因相对表达量的对比情况( 
±s)
2组人表皮干细胞基因本体论富集分析的主要差异表达基因相对表达量的对比情况( ±s)
| 组别 | 样本数 | 上调基因 | 下调基因 | ||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| SPRR2A | S100A7 | IVL | SPRR3 | 角蛋白19 | 角蛋白7 | 角蛋白13 | PI3 | 角蛋白10 | 角蛋白6C | ||
| 对照组 | 3 | 23.6±2.8 | 18±6 | 12.9±0.4 | 5.9±0.5 | 6.5±0.5 | 4.5±0.3 | 18.2±1.4 | 22.0±2.5 | 315.5±3.3 | 424.89±6.09 |
| 富血小板血浆处理组 | 3 | 745.6±57.2 | 2 270±27 | 305.7±6.8 | 498.3±14.8 | 763.4±136.9 | 883.0±50.9 | 871.6±86.3 | 620.2±42.4 | 3.0±0.4 | 7.09±0.12 |
| P值 | <0.001 | <0.001 | <0.001 | <0.001 | <0.001 | <0.001 | <0.001 | <0.001 | <0.001 | <0.001 | |
根据KEGG功能注释结果对差异显著的23个基因进行信号通路显著性富集分析。该分析结果显示，显著差异表达基因主要富集在IL-17信号通路(图5)，主要参与基因分别为运载蛋白2和S100A7基因(表3)。
注：黄色线条表示富集条目下基因的数目；蓝色条带表示-log10（Q值），是对Q值进行的对数转化，转化后数值越大代表差异越显著
2组人表皮干细胞京都基因和基因组信号通路注释分析的差异表达基因相对表达量的对比情况(
±s)
2组人表皮干细胞京都基因和基因组信号通路注释分析的差异表达基因相对表达量的对比情况(±s)
| 组别 | 样本数 | 运载蛋白2 | S100A7 |
|---|---|---|---|
| 对照组 | 3 | 58.7±2.9 | 18±6 |
| 富血小板血浆处理组 | 3 | 6 164.0±183.0 | 2 270±27 |
| P值 | <0.001 | <0.001 |
注：运载蛋白2和S100A7为上调基因
选取了与再上皮化过程相关且差异表达明显的角蛋白19、角蛋白10以及S100A7基因，借助实时荧光定量RT-PCR对其表达量进行了验证，结果与测序数据一致：与对照组比较，PRP处理组角蛋白19 mRNA和S100A7 mRNA表达量明显升高(t＝10.270、5.690，P<0.01)，角蛋白10 mRNA表达量明显降低(t＝7.306，P<0.01)。见图6。
±s)。6A.角蛋白19 mRNA表达量；6B.S100A7 mRNA表达量；6C.角蛋白10 mRNA表达量
注：与对照组比较，aP<0.01
±s)。6A.角蛋白19 mRNA表达量；6B.S100A7 mRNA表达量；6C.角蛋白10 mRNA表达量近年来，PRP促进创面愈合的研究越来越深入，动物实验初步验证了PRP在创面愈合各个阶段的功能，包括其对血管新生、再上皮化以及胶原沉积的调节[13,14,15]。临床和基础研究也证实PRP可以加快创面愈合速度，这与创面再上皮化密切相关[16,17]。再上皮化是创面愈合的重要组成部分，其主要目的是迅速重建屏障功能，PRP促进再上皮化的机制研究以及对相关功能细胞的调控作用尚未阐明。本研究利用RNA-Seq技术在转录组水平初步探讨了PRP影响人ESC生物学功能的可能信号分子。
CD49f又称α6整合素，是早期鉴定ESC的重要标志之一，CD71则代表终末分化细胞(PMD)，在ESC不表达，本研究以此作为依据鉴定ESC。本研究随后采用RNA-Seq测序对PRP处理以及未行PRP处理的原代人ESC进行了转录组分析，通过差异表达基因的筛选，共得到449个差异表达基因，其中上调基因354个、下调基因95个。根据聚类分析筛选出显著差异的23个基因，其中上调基因18个、下调基因5个，进一步行GO富集分析以及KEGG注释分析显示，差异基因显著富集于表皮发育、角化过程以及IL-17信号通路等方面，主要影响角蛋白和趋化因子的表达。初步认为PRP很可能通过靶基因的相互作用，在角化过程和免疫炎症领域发挥对人ESC的调控作用。
为进一步说明PRP调控人ESC功能的靶蛋白，基于测序质控要求以及对应P值，笔者筛选出角蛋白10[18,19]、角蛋白19[20,21]以及S100A7[22]等显著差异表达蛋白基因，这些基因被认为与创面愈合相关，并且可能参与人ESC干性维持以及表皮细胞的增殖分化。并且借助于实时荧光定量RT-PCR对角蛋白10、角蛋白19以及S100A7的表达量进行了验证，结果与转录组数据相符，其中S100A7差异明显，差异大于50%。文献研究报道，根据生物特性的不同，通常将ESC分为3个阶段，分别为ESC、短暂扩增细胞以及PMD[23]，它们与角蛋白10和角蛋白19密切相关，角蛋白19被用于ESC鉴定，角蛋白10则主要在PMD中表达[24]。S100A7是S100家族成员之一，属于钙结合蛋白，主要定位于富含表皮分化复合体的染色体lq21.2～q22区域。研究表明S100A7在促进皮肤分层和创面再上皮化方面扮演着重要的角色[25]，并与局部免疫的激活有潜在联系，具有促进细胞分化[26]、抗凋亡[27]等作用。测序结果显示，PRP处理人ESC后，角蛋白19和S100A7表达量较对照组明显增加，而角蛋白10表达量下降，其中以S100A7差异最为显著，我们认为这可能与钙离子浓度以及PRP质控有关。
钙离子是细胞重要的信号分子，在维持细胞正常功能以及干细胞培养方面具有重要作用，当细胞内外钙离子浓度发生变化时，可通过钙结合蛋白作用于细胞[28]。笔者猜测PRP诱导S100A7分泌，并特异性结合钙离子导致培养基钙离子浓度发生变化，ESC维持在低分化水平。分泌增加的S100A7后续发挥促KC分化功能，诱导再上皮化，同时发挥抗凋亡作用，维持ESC活性，为干细胞进一步分化提供良好的微环境。但是进一步明确S100A7在PRP促进再上皮化和维持表皮稳态中扮演的角色，以及其与角蛋白的交互作用，仍需后续相关的实验验证。
PRP质控标准是影响其临床治疗效果的重要因素，包括激活方式、离心速度和时间以及生长因子浓度等[29,30,31]，同时离体微环境的变化以及血液来源的不同均会影响PRP的功能发挥[32,33,34]。前期研究表明，激活剂选择的不同会影响PRP性状，造成生长因子成分和释放时间的差异[35]，进一步说明了PRP质控具有重要的临床指导意义。本研究采用终体积分数2.5%PRP处理人ESC，测序分析也是基于该体积分数展开，因此进一步分析PRP体积分数变化对角蛋白表达的影响，将为探明PRP如何调控人ESC生物学过程提供更丰富的参考依据。
此外，本文转录组结果显示，PRP处理人ESC还可以引起运载蛋白2在内的多种基因表达变化，但由于和本研究关注的再上皮化过程相关性较小，笔者未对其进行验证和深入分析。转录组测序为后续研究提供了PRP处理条件下某些基因表达的信息，明确这些差异表达基因的相互关系将有助于揭示PRP促进创面再上皮化的可能机制。然而，本研究仅是基于测序数据的初步挖掘，尚未能对所有差异表达基因进行体内外水平的功能验证以及信号机制探讨，有待进一步深入研究，以为临床应用提供质控依据以及治疗靶点。
所有作者均声明不存在利益冲突
