探讨多发性骨髓瘤(MM)患者外周血造血干细胞(HSC)动员获得高比例CD34＋细胞的影响因素。
选择2014年1月解放军总医院海南分院血液科收治的1例64岁MM患者为研究对象。本例患者连续接受4个疗程硼替佐米＋盐酸多柔比星脂质体＋地塞米松方案诱导治疗达完全缓解后，在硼替佐米＋大剂量环磷酰胺(CTX)＋地塞米松方案联合重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)的基础上，同时联合重组人血小板生成素(rhTPO)进行HSC动员，观察其动员效果，并结合近年相关文献进行分析。
HSC采集物中CD34＋细胞比例高达6.80%，单次外周血HSC采集获得单个核细胞含量为3.17×108/kg，CD34＋细胞含量为19.20×106/kg。患者移植后第10天粒细胞植入，移植后第12天血小板植入。
对于MM患者，在联合rhG-CSF化疗基础上，再联合rhTPO进行HSC动员，安全、高效。本研究高效动员外周血HSC仅为个案报告，是否可于MM患者中广泛推广、应用，仍需更多大样本、多中心的随机对照试验进一步证实。
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多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是来源于浆细胞的克隆性疾病，尽管应用硼替佐米、来那度胺等新药治疗，其疗效明显提高，但目前MM仍难以治愈[1]。自体造血干细胞移植(autologus hematopoietic stem cell transplantation，auto-HSCT)作为MM的一线治疗方案，可明显提高患者治疗疗效，并延长生存时间和改善生存质量[1,2]。MM患者经诱导治疗后，能否经过造血干细胞(hematopoietic stem cell，HSC)动员，并采集到足够数量外周血HSC，是其能否进行auto-HSCT的决定因素[2]。因患者疾病状况、既往治疗方式、HSC动员方案和采集措施等诸多因素影响，自体外周血HSC的动员、采集效果存在较大差异[3,4,5,6]。
大剂量环磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)联合重组人粒细胞集落刺激因子(recombinant human granulocyte colony-stimulating factor，rhG-CSF)，是目前最常用于MM患者外周血HSC动员的方案[3]。大剂量CTX通过释放蛋白酶降解关键黏附分子，如血管细胞黏附分子-1与趋化因子受体-4等，进而促进HSC从骨髓释放，进入外周血。大剂量CTX可明显增强rhG-CSF的动员效果[3]。解放军总医院海南分院血液科在采用硼替佐米＋大剂量CTX＋地塞米松方案联合rhG-CSF的基础上，同时联合重组人血小板生成素(recombinant human thrombopoietin，rhTPO)进行MM患者HSC动员，并获得良好动员效果，HSC采集物中CD34＋细胞比例高达6.80%，而国内、外尚无文献报道外周血HSC动员使CD34＋单次采集比例达到如此高水平[3,4,5,6]，现将研究结果报道如下。
选择2014年1月10日解放军总医院海南分院血液科收治的1例MM患者为研究对象。本例患者为男性，汉族，年龄为64岁，体质量为62 kg。患者于2013年9月无明显诱因出现腰痛，局部按摩腰部可减轻疼痛。2013年12月腰痛进行性加重，伴乏力症状。2014年1月10日入本院血液科治疗。入院查体：贫血貌，皮肤黏膜无出血点、淤斑，浅表淋巴结无肿大，心、肺查体功能无异常。腹软，无压痛，肝、脾于肋下未触及，双下肢无水肿。双侧肋骨压痛明显，第3～4腰椎及双侧腰大肌压痛明显。入院后CT检查结果示：胸椎、腰椎及骶椎多发性骨质破坏；PET/CT检查结果示：第8，10胸椎，第3，4腰椎和骶椎骨质破坏，骨代谢稍增高。血常规检查结果示：血红蛋白(hemoglobin，Hb)水平为72 g/L，白细胞计数为3.6×109/L，血小板计数为197×109/L。肝、肾功能正常，白蛋白水平为33.4 g/L，血清钙水平正常。凝血功能正常。血β2-微球蛋白为5.32 mg/L，免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)A为52.8 g/L，IgG为3.93 g/L，IgM为0.204 g/L，Ig轻链κ为17.5 g/L，Ig轻链λ为0.42 mg/L。血清免疫固定电泳检测结果示IgA-κ型阳性。骨髓涂片可见骨髓瘤细胞占40%。骨髓组织病理学检查结果示：骨髓增生明显活跃，浆细胞呈大片状增生。骨髓细胞免疫分型结果示：单克隆浆细胞占19%，其免疫表型为CD38＋、CD138＋、CD19－及CD56＋，细胞内Ig轻链κ限制性表达。综合上述检查结果，诊断为MM IgA-κ型，Durie-Salmon分期为ⅢA期，国际分期系统(International Staging System，ISS)分期为Ⅱ期。
外周血HSC动员前诱导治疗方案为硼替佐米1.3 mg/m2，d1，4，8，11，皮下注射＋盐酸多柔比星脂质体35 mg/m2，d1，静脉输注＋地塞米松20 mg/d，d1，2，4，5，8，9，11，12，静脉输注，并应用二磷酸盐类药物预防治疗骨质破坏。患者接受上述化疗方案治疗4个疗程后，再行骨髓穿刺、血清及尿液免疫固定电泳等检查，评估化疗疗效。
外周血HSC动员方案为：在硼替佐米＋大剂量CTX＋地塞米松方案联合rhG-CSF基础上，同时联合rhTPO化疗。具体化疗方案为：硼替佐米1.3 mg/m2，d1，4，8，11，皮下注射＋地塞米松20 mg/d，d1，4，8，11，静脉输注＋大剂量CTX 3 g/m2，d8，静脉输注，并予以美司钠减轻大剂量CTX的不良反应。化疗后监测患者血常规，当血小板计数<50×109/L时，予以rhTPO 15 000 U/d皮下注射，直至HSC采集结束。待白细胞计数下降至最低后(注：此时无特殊用药)并连续2 d上升时，给予rhG-CSF 10 μg/(kg·d)皮下注射，进行HSC动员，直至HSC采集结束。
应用MCS＋型血细胞分离机(美国Haemonetics公司)人工辅助采集模式，采集本例MM患者的外周血HSC。采集过程共进行2.5个循环，总循环血量为10 068 mL。应用台盼蓝染色法检测HSC的细胞活性。应用XT-4000i型血细胞分析仪(日本Sysmex公司)进行外周血单个核细胞计数，应用FACSCalibur型流式细胞仪(美国BD公司)检测分析CD34＋细胞比例，CD34＋细胞检测方法为标准化血液病治疗及移植国际联合会(International Society of Hematotherapy and Graft Engineering，ISHAGE)方案[7]。流式细胞技术中所用荧光抗体CD45－异硫氰酸荧光素(fluorescein-5-isothiocyanate，FITC)(批号：5189953)，CD34－巯基化藻红蛋白(phycoerythrin，PE)(批号：5110822)及溶血素(批号：3247528)均购自美国BD公司。
患者药浴后进入百级无菌层流病房，常规预防细菌、真菌及病毒感染，预处理期间水化、碱化尿液，改善微循环、维持电解质平衡。回输HSC前的化疗预处理方案为大剂量美法仑180 mg/m2，并于预处理后第2天回输HSC。当Hb水平<70 g/L时输注红细胞悬液，当血小板计数<20×109/L时输注机采血小板治疗。若治疗过程中，患者体温超过38 ℃时，则给予静脉输注广谱抗菌药物治疗。
外周血HSC动员前对本例MM患者诱导治疗效果的评估结果示，其血β2-微球蛋白为2.4 mg/L、IgA为0.36 g/L、IgG为4.98 g/L、IgM为0.324 g/L、血清轻链κ为1.28 g/L、血清轻链λ为0.58 g/L，尿轻链κ为9 mg/L，尿轻链λ<4 mg/L。血清及尿液的免疫固定电泳检查结果均显示为MM IgA-κ型阴性。骨髓涂片检查未见浆细胞。疗效评估为完全缓解[8]。
本例MM患者于rhG-CSF用药第5天的血常规检查结果示：白细胞计数为66.92×109/L，Hb水平为105 g/L，血小板计数为483×109/L，单个核细胞比例为11%，达到外周血HSC采集标准。因此，对其于rhG-CSF动员的第5天进行外周血HSC采集，其中外周血HSC采集物总体积为156 mL，单个核细胞计数为1.3×108/mL，台盼蓝染色拒染率为100%。对采集的外周血HSC进行流式细胞技术检测结果显示，CD34＋细胞比例为6.80%，见图1。单次采集外周血HSC后获得单个核细胞含量为3.17×108/kg，CD34＋细胞含量为19.20×106/kg。
注：SSC-height：侧向角散射光信号高度(side scatter-height)，指流式细胞仪中与激光束正交90°方向的散射光信号强度，代表细胞颗粒度；FSC-height：前向角散射光信号高度(forward scatter-height)，指流式细胞仪中与激光束平行方向的散射信号强度，代表细胞大小；FITC：异硫氰酸荧光素(fluorescein-5-isothiocyanate)；PE：巯基化藻红蛋白(phycoerythrin)
对本例患者于移植后第4天开始给予rhG-CSF与rhTPO，促进造血功能恢复。于移植后第10天进行造血功能检测结果显示，中性粒细胞计数>0.5×109/L。移植后第12天检测结果显示，血小板计数>20×109/L。本例MM患者移植过程中共计静脉输注辐照去白细胞机采血小板2 U，未输注红细胞。
有效的HSC动员及采集是auto-HSCT治疗的关键。对MM患者采取单用rhG-CSF或常规化疗，均可动员部分HSC从骨髓释放至外周血中，但二者联合应用，可明显增加动员后外周血HSC的数量[3]。大剂量CTX一方面可动员HSC，另一方面还可有效降低骨髓瘤细胞负荷，因此被广泛应用于MM患者的自体HSC动员[3]。CD34是造血干/祖细胞的表面标志物。CD34＋细胞作为衡量HSC动员效果的主要指标，其数量的多少与移植后造血重建直接相关[9]。外周血HSC采集物中CD34＋细胞含量达到2×106/kg，是目前进行auto-HSCT的基本要求[9]。文献报道，对MM患者进行auto-HSCT治疗时，若回输的CD34＋细胞含量达到15×106/kg，可显著缩短造血功能重建时间，并减少输注红细胞及血小板的数量[9]。
由于外周血HSC的采集效果受患者疾病状况、既往治疗方式、HSC动员和采集方案等多种因素影响，因此不同研究报道的HSC动员和采集效果存在较大差异[3,4,5,6]。健康个体外周血CD34＋细胞仅占外周血单个核细胞的0.01%～0.10%[10]。斯晓明等[11]对81例恶性肿瘤患者进行HSC动员后，采集的外周血HSC悬液中，CD34＋细胞比例为(0.60±0.11)%。肖扬等[4]对4例MM患者进行HSC动员后，采集的CD34＋细胞比例为(1.17±0.29)%；对7例白血病患者进行HSC动员后，采集的CD34＋细胞比例为(2.12±0.78)%；对7例非霍奇金淋巴瘤患者进行HSC动员后，采集的CD34＋细胞比例为(2.47±0.65)%。其研究结果还显示，MM患者的HSC动员效果均较其他血液病患者差，且差异均有统计学意义(P<0.05)。为获得足够数量的HSC，对MM患者进行HSC动员后，可能需要连续采集HSC 2～3次，才能满足移植需要量。本例MM患者进行HSC动员后，HSC采集物中CD34＋细胞比例高达6.80%，单次采集外周血HSC悬液中，CD34＋细胞含量达到19.20×106/kg，单次采集的外周血HSC悬液中CD34＋细胞比例和含量达到如此之高的水平，在国内、外尚未见相关文献报道[3,4,5,6]。
影响HSC动员及采集效果的因素包括患者年龄、HSC动员前化疗方案、移植次数、HSC动员方案、采集时机、动员前及采集外周血中HSC数量等。李勤等[5]报道，CD34＋细胞产率与动员前化疗次数，Drake化疗积分及血常规指标恢复时间相关，而与动员方案及动员前外周血白细胞计数等因素无明显相关性。本例患者可获得如此高效的动员效果，究其原因可能为：①对其采用包含硼替佐米的方案进行诱导治疗。硼替佐米为蛋白酶体靶向药物，HSC动员前的诱导治疗过程对骨髓造血干/祖细胞和基质细胞损伤小，有利于后期的HSC动员[6]。②在HSC动员过程中，对本例患者所使用的rhTPO与rhG-CSF联合动员方案，二者具有协同作用[12,13,14,15]。研究结果证实，TPO不仅对巨核细胞各阶段生长及分化有刺激作用，还可通过促进巨核细胞释放趋化因子受体-2配体，参与HSC的动员过程[12]。给予rhG-CSF后，可快速诱导患者骨髓内TPO浓度增加，而在缺乏TPO受体的小鼠模型中，rhG-CSF动员能力则明显下降[12]。另有研究发现，TPO还可在体外直接刺激HSC生长及分化[13,14]。Linker等[15]对134例进行auto-HSCT治疗的患者的研究发现，rhG-CSF联合rhTPO动员组HSC动员效果优于单用rhG-CSF动员组，两组患者中CD34＋细胞含量达到2×106/kg的比例分别为92%与75%，但二者比较，差异无统计学意义(P＝0.050)；但两组患者获得的CD34＋细胞含量达到5×106/kg的比例分别为73%和46%，二者比较，差异却有统计学意义(P＝0.041)。③对本例患者采用采集效果较优的血细胞分离机的人工辅助采集模式进行HSC采集。人工辅助采集模式可在HSC采集过程中，根据实时数据对相应参数进行调整，因此采集效果优于目前广泛应用的全自动采集模式，但对操作人员的技术和经验要求更高[16]。周俊等[16]对87例健康供者进行HSC动员后，分离外周血HSC，对其中52例患者采用人工辅助采集模式，35例患者采用全自动采集模式进行HSC采集的结果显示，人工辅助采集模式组外周血HSC采集物中CD34＋细胞比例为(0.58＋0.19)%，显著高于全自动采集模式组的(0.28＋0.10)%，且差异有统计学意义(P<0.05)。
足够数量的HSC是确保auto-HSCT成功的先决条件，并且与auto-HSCT后造血功能重建效果密切相关[9]。优化HSC动员方案，对于提高auto-HSCT成功率具有重要意义。本例患者良好的HSC动员效果使HSC采集一次成功，避免多次采集，减少auto-HSCT后血液制品输入，缩短造血重建时间。对于需要进行auto-HSCT治疗的患者，在HSC动员过程中联合应用rhG-CSF和rhTPO，有可能使HSC动员获得更为良好的效果。血细胞分离机的人工辅助采集模式为更适宜的HSC采集模式。为明确对本方案对提高HSC动员效果有效性，还需要更多病例的积累，以及对HSC动员机制的进一步深入研究。
